Structural regulation of translation initiation factor eIF3E in plant gametophytes

• Název práce v češtině: Strukturní regulace translačního iniciačního faktoru eIF3E u rostlinných gametofytů
• Název v anglickém jazyce: Structural regulation of translation initiation factor eIF3E in plant gametophytes
• Klíčová slova: Translation, male gametophyte, CLIP/RIP-seq, mRNA storage
• Klíčová slova anglicky: Translation, male gametophyte, CLIP/RIP-seq, mRNA storage
• Akademický rok vypsání: 2018/2019
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Katedra experimentální biologie rostlin (31-130)
• Vedoucí / školitel: Said Hafidh
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 23.10.2018
• Datum zadání: 23.10.2018
• Datum odevzdání elektronické podoby: 26.03.2025
• Datum proběhlé obhajoby: 04.04.2025
• Oponenti: Jörg Dieter Becker, Ph.D.
• Konzultanti: prof. RNDr. David Honys, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Syntéza proteinů představuje jeden z obecných a nezbytných procesů probíhajících ve všech živých organizmech. Je primárně regulována v počátečním stadiu, na úrovni iniciace translace, jež je pak řízena řadou translačních iniciačních faktorů. S ohledem na velkou vývojovou plasticitu rostlin, iniciační faktory translace přijímají a reagují na různé vývojové a environmentální signály, které ovlivňují mimo jiné i celkovou a specifickou translatovatelnost mRNA. Byla popsáno několik translačních iniciačních faktorů, jako např. eIF3, eIF4A, eIF4E, eIF4G a eIF5A, které se uplatňují během sporofytického a gametofytického vývoje.
Komplex eukaryotického translačního iniciačního faktoru 3 (eIF3) představuje velký a značně konzervovaný proteinový komplex, který se podílí na rozpoznávání elementů v mRNA zejména v blízkosti 5'-čepičky a významným, byť dosud ne plně popsaným způsobem, se podílí na zahájení translace. Komplex eIF3 se skládá se z devíti hlavních podjednotek tvořících jeho jádro: eIF3A, eIF2B1, eIF3B2, eIF3C1, eIF3C2, eIF3D, eIF3E, eIF3F, eIF3G1, eIF3G2, eIF3H a eIF3K. Z uvedeného je patrné, že tři podlednotky mají každá dvě isoformy. Cílem tohoto doktorského studijního projektu je prozkoumat prostorově-časové profily podjednotek eIF3B1, eIF3B2 a eIF3E v Arabidopsis thaliana a pomocí reverzní genetiky popsat způsob jejich regulace v samčím gametofytu. Již jsme zjistili, že mutantní linie T-DNA s vyřazeným genem pro eIF3b1 ovlivňují životaschopnost sporofytu, ale nevykazují dominantní účinek na gametofyt pravděpodobně z důvodu funkční redundance mezi oběma isoformami podjednotky eIF3B. Tyto výsledky naznačují, že eif3b1 je pravděpodobně embryo-letální mutací, což naznačuje, že úloha eIF3B2 je omezena jen na gametofyt a nikoliv během embryogeneze či následného sporofytického vývoje. Naše delší předběžné ukazují, že inserčním mutace eif3e je letální jen pro vývoj samčího gametofytu, avšak vývoj samičího gametofytu zůstává nedotčen. Zůstává nejasné, co způsobuje redundanci eIF3E jako jediného lokusu v samičím gametofytu (Filip Linhart, diplomová práce 2017). Pro charakterizaci a dešifrování role eIF3B1, eIF3B2 a eIF3E v samčím gametofytu Arabidopsis thaliana jsme naplánovali následující experimenty:

Rok 1:
A. Generování kompletních knockout mutantů eif3b1 eif3b2 a eIF3e pomocí techniky CRIPSR-Cas9.
b. Transformace rostlin Arabidopsis thaliana s příslušnými konstrukty.
C. Genotypování CRISPR mutantů za použití různých metod, jako je Sangerovo sekvenování Sanger, MSBSP (mutation site based specific primers PCR) nebo restrikčním štěpením (T7 endonukleáza I).
d. Generování dvojitých mutantů eif3b1 eif3b2 v mutantním pozadí mutace quartet (qrt)
E. Pull-down test s použitím již připravených konstruktů proeIF3B1-eIF3B1, eIF3B2 a pro-eIF3E-eIF3e značených eGFP a FLAG pro provedení CLIP/RIP-seq analýzy a stanovení vazebných mRNA cílů výše uvedených proteinů.
F. Příprava rozvržení prvního rukopisu

Rok 2:
A. Charakterizace nových cílových genů z CLIP/RIP-seq analýzy pomocí reverzní genetiky s použitím CRISPR Cas9 mutageneze a značení proteinů pro lokalizaci.
b. Screening dvojitého mutantního eif3b1 eif3b2 a hledání sporofytických, gametofytických a post-fertilizačních fenotypových defektů.
C. Dokončení screeningu CRISPR Cas9 mutantů.
d. Analýza přenosu a segregace mutantních linií.
E. Komplementace ověřených mutantních alel.
F. Práce na prvním rukopisu a jeho odeslání

Rok 3:
A. Kolokalizace eIF3B1/B2 s kandidátskými mRNA pomocí imunolokalizované konjugované RNA-FISH.
b. V případě příznivých časových možností otestujeme možné interakce zkoumaných proteinů s nezávislými kandidáty pomocí Y1H analýzy.
C. Příprava dalšího rukopisu.

Rok 4:
Dokončení experimentů Publikace rukopisů. Sepsání a odevzdání Ph.D. dizertace

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Protein synthesis is a pervasive and an essential process in all living organisms. Primarily, protein synthesis is regulated at the translation initiation stage, which is driven by several translation initiation factors. To guide plant developmental plasticity, translation initiation factors perceive various developmental and environmental cues to influence cell as well as mRNA specific translatability and hence cellular function. There are various translation initiation factors, such as eIF3, eIF4A, eIF4E, eIF4G, and eIF5A that function during sporophytic and gametophytic development.
Eukaryotic translation initiation factor 3 complex (eIF3) is a highly well preserved protein complex that is involved in the recognition of 5’- CAP elements of the mRNA to initiate translation. It consists of nine core subunits, three of them having two isoforms: eIF3A, eIF2B1, eIF3B2, eIF3C1, eIF3C2, eIF3D, eIF3E, eIF3F, eIF3G1, eIF3G2, eIF3H and eIF3K. The objective of this PhD is to investigate the spatial-temporal profiles of eIF3B1, eIF3B2 and eIF3E in Arabidopsis thaliana and using reverse genetics to establish their mode of regulation in the male gametophyte. It has already been reported that eif3b1knockout T-DNA mutant lines affectsviability in the sporophyte but it did not show dominant effect in the gametophyte likely because of the functional redundancy between the eIF3B subunits. These results suggest that eif3b1is likely embryo lethal, implying that the supporting role of eIF3B2is restricted to the gametophyte and not during embryogenesis. Conversely, our preliminary results show that eif3eknockout mutant is male gametophytic lethal, however, the female gametophyte remain unaffected. It remain unclear what cause eIF3E redundancy in the female gametophyte as a single locus(Mgr. Filip Linhart., 2017). We believe that the collection of Salk line mutants are not a complete knock out mutants. Therefore in order to characterize and decipher the role of eIF3B1, eIF3B2 and eIF3E in Arabidopsis thaliana we planned the following experiments:
Year 1:
a. Generationof complete knockout mutants ofeif3b1 eif3b2and eIF3ethrough CRIPSR Cas9 technique.
b. Transformation of Arabidopsis thaliana plants with respective constructs.
c. Genotyping of CRISPR mutants using different methods such as Sanger sequencing, MSBSP (mutation site based specific primers PCR), surveyers assay, or by restriction digestion (T7 endonuclease I).
d. Generation ofeif3b1 eif3b2double mutants T-DNAs inquartet(qrt) mutant background
e. Pull-down assay using already prepared constructs of proeIF3B1-eIF3B1, eIF3B2 and pro-eIF3E-eIF3e tagged with eGFP and FLAG tags to perform CLIP/RIP-seq analysis and establish bound mRNA targets of the aforementioned proteins.
f. Structure a layout and chapters for forecasted manuscripts

Year 2:
a. Characterization of novel target genes from CLIP/RIP-seq assay by reverse genetics using CRISPR Cas9 mutagenesis and protein tagging for localization).
b. Screening of double mutant eif3b1 eif3b2sporophytic, gametophytic and post-fertilization phenotype.
c. Completion of CRISPR Cas9 mutants screen.
d. Transmission and segregation analysis of mutant lines.
e. Complementation of the verified mutant alleles.
f. Initiate manuscripts writing for publication
Year 3:
a. Co-localization of eIF3B1/B2 with candidate’s mRNAs by immunolocalization coupled RNA-FISH.
b. If time permits, perform Y1H RNA-protein interaction for independent candidates verification.
c. Manuscripts preparation.
Year 4:
a. Manuscripts publication.
Submission of Ph.D. thesis