Congenital disorders of glycosylation and their impact on cellular and energetic metabolism

• Název práce v češtině: Dědičné poruchy glykosylace a jejich dopad na buněčný a energetický metabolismus
• Název v anglickém jazyce: Congenital disorders of glycosylation and their impact on cellular and energetic metabolism
• Klíčová slova: dědičné poruchy glykosylace, bioenergetika, dolichol, stres endoplasmatického retikula
• Klíčová slova anglicky: congenital disorders of glycosylation, bioenergy, dolichol, endoplasmic reticulum stress
• Akademický rok vypsání: 2018/2019
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Klinika pediatrie a dědičných poruch metabolismu 1. LF UK a VFN (11-00650)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Hana Hansíková, CSc.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 17.10.2018
• Datum zadání: 17.10.2018
• Datum a čas obhajoby: 30.11.2023 14:00
• Místo konání obhajoby: Velká zasedací místnost děkanátu 1. LF UK
• Datum odevzdání elektronické podoby: 03.10.2023
• Datum proběhlé obhajoby: 30.11.2023
• Předmět: Obhajoba dizertační práce (B90002)
• Oponenti: prof. RNDr. Petr Hodek, CSc.

Předběžná náplň práce

Dědičné poruchy glykosylace („Congenital disorders of glycosylation“ - CDG syndrom) tvoří rozsáhlou skupinu více než 100 typů metabolických onemocnění způsobených poruchami biosyntézy a úpravy N- a O- vázaných glykoproteinů a glykolipidů, které jsou u člověka součástí většiny katalytických, transportních i strukturních proteinů. CDG se obvykle manifestují již v kojeneckém věku jako multisystémové onemocnění s postižením funkce mozku, jater, střev a srdce. Progredující charakter onemocnění, nepříznivá prognóza a až na vyjímky nedostupná léčba tak představují v postižených rodinách závažný zdravotnický problém.
V průběhu minulých let jsme v Laboratoři pro studium mitochondriálních poruch geneticky potvrdili více než 50 pacientů s 11 různými typy CDG a vytvořili soubor dalších 30 pacientů, u kterých jsme na základě biochemických nálezů vyslovili podezření pro toto onemocnění. Naše poslední studie ukázaly, že glykosylace a regulační procesy s ní spojené mohou ovlivňovat celou řadu dějů na všech intra a extrabuněčných a metabolických úrovních.

Cílem postgraduálního studia bude:
Charakterizovat biochemickou a molekulární podstatu onemocnění u pacientů s podezřením na poruchu glykosylace;
Rozšířit vyšetřovací program CDG pomocí nově zavedených biochemických a proteomických metod;
Hledat podstatu „ sekundárních“ poruch porušené glykosylace proteinů a studovat souvislosti s různými metabolickými procesy za různých patologických stavů;
Studovat dopad vzácných typů CDG syndromu na buněčný/energetický metabolismus na úrovni buněčných linií.

Studijním materiálem budou séra, vzorky moče, izolovaná DNA a unikátní buněčné linie fibroblastů od pacientů, u kterých bylo vysloveno podezření na CDG nebo tato diagnóza již byla potvrzena. Základní diagnostické markery sérový transferin a Apolipoprotein CIII budou analyzovány pomocí izoelektrické fokusace s následnou imunofixací a western blotem. Změny v morfologii buněčných organel na úrovni kultivovaných fibroblastů budou studovány pomocí elektronové, fluorescenční a konfokální mikroskopie. Struktura glykanů v séru a dolicholů v moči bude analyzována pomocí MALDI-TOF MS (ve spolupráci se spolupracujícími pracovišti (UDMP, Bratislava, Nijmegen). Analýza vybraných genů kódujících enzymy dráhy glykosylace bude prováděna pomocí NGS. Mitochondriální energetický metabolismus bude studován pomocí palety dobře na pracovišti zavedených metod např. polarografie (vysoce citlivý oxygraf), spotřeby kyslíku v reálném čase ( Seahorse Analyzer) a spektrofotometrie.

Předložené téma doktorandského studia je plně v souladu s dlouhodobým výzkumným zaměřením Laboratoře pro studium mitochondriálních poruch při Klinice dětského a dorostového lékařství a navazuje na její bakalářskou práci: Dědičné poruchy glykosylace: alfa-dystroglykanopatie a diplomovou práci „Analýza obsahu dolicholu v moči u pacientů s dědičnými poruchami glykosylace pomocí hmotnostní spektrometrie“, které v letech 2015-2018 na našem pracovišti vypracovala. Výsledky navrhovaného projektu budou využity pro zkvalitnění diagnostiky CDG syndromu a genetického poradenství v postižených rodinách a významně přispějí k objasnění patologického mechanismu vzniku této široké skupiny onemocnění.

Experimenty budou finančně zajištěny Výzkumnými projekty: AZV 16-31932A, Progres P26 a RVOVFN64165.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Congenital disorders of glycosylation (CDG) constitute a large group of more than 100 types of metabolic diseases caused by biosynthesis and modification defects of N- and O-glycans bounded to proteins and lipids. Glycans are part of most of catalytic, transport and structure proteins in human. CDG usually manifest in infant age as multisystem disease with disability of brain, liver, intestine and heart. The progressive nature of the disease, unfavorable prognosis and, with exceptions, unavailable treatment thus represent serious medical problem in affected families.

During last years team of our Laboratory for study of mitochondrial disorders (Mitolab) genetically confirmed more than 50 patients with 11 different types of CDG. Furthermore, based on biochemical findings we created a set of 30 patients suspected for CDG. Our recent studies have shown, that glycosylation and associated regulatory processes can affect a variety of metabolic pathways at intra and extracellular levels.
The aim of post gradual study is:
To characterize biochemical and molecular basis of diseases in patients suspected for congenital disorders of glycosylation
To expand the investigative program for CDG using newly introduced biochemical and proteomics methods.
To search for the basis of secondary disturbances in defective protein glycosylation and to study the context with different metabolic pathways under various pathological conditions.
To study the impact of rare type of CDG syndrome on cellular/energetic metabolism in cell lines.
Material for study will be consisted of serum, urine samples, isolated DNA and unique fibroblast cell lines of patients suspected for CDG syndrome or with confirmed CDG. Basic diagnostic markers serum transferrin and apolipoprotein CIII will be analyzed by isoelectric focusing followed by immunofixation and western blotting. Changes in cell organelles morphology will be studied using electron, fluorescent and confocal microscopy in fibroblast cell lines. Glycan structure in serum and dolichol structure in urine samples will be analyzed by MALDI-TOF/MS (in cooperation with collaborators (ÚDMP, Bratislava, Nijmegen)). Analysis of selected genes encoding enzymes of glycosylation pathway will be performed by NGS. Mitochondrial energetic metabolism will be studied by using well-established methods in laboratory, i.e. polarography (high sensitivity oxygraph), oxygen consumption in real time (Seahorse Analyzer), and spectrophotometry.

Presented topic of post gradual study is fully consistent with long-term research focus of Mitolab at Department of Pediatric and Adolescent Medicine. PhD study of Lucie will be follow-up of her Bachelor thesis: „Congenital disorders of glycosylation: alpha-dystroglycanopaties“ and Master thesis: „Dolichol analysis content in urine of patients with congenital disorders of glycosylation by mass spectrometry“ (successfully defended in 2015 and 2018 respectively). Results of suggested project will be used for better quality of CDG diagnosis and genetics counseling in affected families and will bring a significant contribution to understanding of pathological mechanisms origin of this broad group of diseases.

Experiments will be financially supported by research projects: AZV 16-31932A, Progress Q26 and RVOVFN64165