Inženýrství mikrobiálních glykosidáz pro změnu syntetického potenciálu
| Název práce v češtině: | Inženýrství mikrobiálních glykosidáz pro změnu syntetického potenciálu |
|---|---|
| Název v anglickém jazyce: | Engineering of microbial glycosidases for modifying synthetic potential |
| Klíčová slova: | Bacillus circulans, cílená mutageneze, Escherichia coli, β-galaktosidáza, galaktosylace, glykosyntáza, PCR, rekombinantní exprese |
| Klíčová slova anglicky: | Bacillus circulans, Escherichia coli, β-galactosidase, galactosylation, glycosynthase, PCR, recombinant expression, targeted mutagenesis |
| Akademický rok vypsání: | 2018/2019 |
| Typ práce: | diplomová práce |
| Jazyk práce: | čeština |
| Ústav: | Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140) |
| Vedoucí / školitel: | doc. RNDr. Pavla Bojarová, Ph.D. |
| Řešitel: | skrytý - zadáno vedoucím/školitelem, čeká na schválení garantem |
| Datum přihlášení: | 10.10.2018 |
| Datum zadání: | 26.11.2018 |
| Datum odevzdání elektronické podoby: | 06.06.2020 |
| Datum proběhlé obhajoby: | 13.07.2020 |
| Oponenti: | RNDr. Irena Lichá, CSc. |
| Seznam odborné literatury |
| Literatura:
K. Slámová, P. Bojarová, Engineered N-acetylhexosamine-active enzymes in glycoscience, Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj., 1861(8), 2017, 2070-2087. D. Laaf, P. Bojarová, H. Pelantová, V. Křen, L. Elling, Tailored Multivalent Neo-Glycoproteins: Synthesis, Evaluation, and Application of a Library of Galectin-3-Binding Glycan Ligands. Bioconjug. Chem., 28(11), 2017, 2832–2840. J. Song, H. Imanaka, K. Imamura, M. Minoda, T. Katase, Y. Hoshi, S. Yamaguchi, K. Nakanishi, Cloning and expression of a β-galactosidase gene of Bacillus circulans. Biosci Biotechnol Biochem., 75(6), 2011,1194-1197. J. Song, K. Abe, H. Imanaka, K. Imamura, M. Minoda, S. Yamaguchi, K. Nakanishi, Causes of the production of multiple forms of β-galactosidase by Bacillus circulans. Biosci Biotechnol Biochem., 75(2), 2011, 268-278. H. Yin, T. Pijning, X. Meng, L. Dijkhuizen, S. S. van Leeuwen, Biochemical Characterization of the Functional Roles of Residues in the Active Site of the β-Galactosidase from Bacillus circulans ATCC 31382. Biochemistry, 56(24),2017,3109-3118. |
| Předběžná náplň práce |
| Stav problematiky a cíl práce:
Oligosacharidy na bázi N-acetylhexosaminů zakončené β-galaktosidem jsou účinnými inhibitory galektinů. Enzymová syntéza pomocí glykosidáz umožňuje využít unikátní tolerantnosti těchto enzymů vůči strukturním modifikacím v substrátové molekule, jejich obvykle vysokého výtěžku při rekombinantní produkci a dobré stability, a tak připravit cíleně funkcionalizované sacharidové inhibitory s vysokou afinitou ke galektinům. Pro tento účel lze s výhodou kombinovat enzymy β-galaktosidázy a β-N-acetylhexosaminidázy v sekvenčních enzymových reakcích. Cílem práce je připravit rekombinantní β-galaktosidázu z Bacillus circulans a alespoň jednu její kratší izoenzymovou variantu, prostudovat vlastnosti a využitelnost připravených enzymů pro syntézu funkcionalizovaných sacharidových epitopů odvozených od N-acetyllaktosaminu (LacNAc) a u jednoho vybraného enzymu provést cílenou mutagenezi na základě molekulárního modelování za účelem zvýšení výtěžku syntetické reakce. Úkoly: · exprimovat syntetický gen β-galaktosidázy z Bacillus circulans v E. coli a optimalizovat produkci enzymu · stanovit biochemické parametry enzymu, substrátovou specifitu, regioselektivitu a syntetický potenciál · připravit gen alespoň jedné zkrácené varianty β-galaktosidázy pomocí PCR a provést jeho ligaci do expresního vektoru · exprimovat připravený gen zkrácené varianty v E. coli a optimalizovat produkci enzymu · navrhnout bodové mutace pro zvýšení syntetického výtěžku a/nebo snížení hydrolytické aktivity enzymu na základě molekulárního modelování (spolupráce s Dr. Kulik, MBÚ Nové Hrady) · připravit a charakterizovat alespoň jednu mutantní variantu β-galaktosidázy Metody: · vyhledávání v databázích genů a sekvenční analýza · PCR a transformace expresního vektoru · exprese genů v E. coli a screening · produkce enzymů v E. coli a jejich purifikace · stanovení enzymových aktivit a kinetických parametrů · analýza reakčních směsí pomocí HPLC |
| Předběžná náplň práce v anglickém jazyce |
| State od the art and the aims of the work:
N-Acetylhexosamine-based oligosaccharides terminated with β-galactoside are efficient galectin inhibitors. Enzymatic synthesis catalyzed by glycosidases makes use of the unique tolerance of these enzymes towards structural modifications in the substrate molecule, their usually high yield of recombinant production and good stability. Thus, tailored functionalized carbohydrate inhibitors with a high affinity to galectins may be prepared. For this aim, β-galactosidases and β-N-acetylhexosaminidases may be combined in sequential enzymatic reactions. The aim of this work is to prepare recombinant β-galactosidase from Bacillus circulans and at least one its isoenzyme variant, study their properties and applicability of the prepared enzymes for the synthesis of functionalized carbohydrate epitopes derived from Galβ4GlcNAc (LacNAc). In one selected enzyme, site-directed mutagenesis should be performed on the basis of molecular modelling, aimed at increasing the yield of the synthetic reaction. Aims: · express the synthetic gene of the β-galactosidase from Bacillus circulans in E. coli and optimize the enzyme production · determine the biochemical parameters of the enzyme, its substrate specificity, regioselectivity and synthetic potential · prepare the gene of at least one truncated variant of the β-galactosidase by PCR and ligate it into the expression vector · express the prepared gene of the truncated enzyme variant in E. coli and optimize the enzyme production · propose point mutations for the increase of synthetic yield and/ or for the reduction of its hydrolytic activity on the basis of molecular modelling (collaboration with Dr. Kulik, MBÚ Nové Hrady) · prepare and characterize at least one mutant variant of the β-galactosidase Methods: · search in the gene databases and sequentional analysis · PCR and transformation of the expression vector · expression of the genes in E. coli and screening · production of the enzymes in E. coli and their purification · determination of enzyme activities and kinetic parameters · analysis of reaction mixtures by HPLC |