Měření intracelulárního pHi kvasinek S. cerevisiae v suspenzích a individuálních buňkách

• Název práce v češtině: Měření intracelulárního pHi kvasinek S. cerevisiae v suspenzích a individuálních buňkách
• Název v anglickém jazyce: Measurement of intracellular pHi of S. cerevisiae yeast in suspensions and individual cells
• Klíčová slova: kvasinky; Saccharomyces cerevisiae; vnitrobuněčné pH; pHluorin; fluorescence; mikroskopie
• Klíčová slova anglicky: yeast; Saccharomyces cerevisiae; intracellular pH; pHluorin; fluorescence; microscopy
• Akademický rok vypsání: 2021/2022
• Typ práce: diplomová práce
• Ústav: Fyzikální ústav UK (32-FUUK)
• Vedoucí / školitel: prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc.
• Konzultanti: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.

Zásady pro vypracování

1. Osvojit si základní techniky práce v mikrobiologické laboratoři, kultivaci bakterií a kvasinek

2. Zvládnout základy fluorescenční spektroskopie a seznámit se s metodou měření intracelulárního pHi kvasinek pomocí fluorescenčního
proteinu pHluorinu.

3. Podílet se na konstrukci světlovodného propojení fluorimetru Fluoromax3 s fluorescenčním mikroskopem Olympus IX70

4. Ověřit platnost kalibrace měření pHi suspenzí kvasinek S. cerevisiae značených pHluorinem pro případ měření se světlovodným adaptérem.

5. Porovnat střední hodnoty pHi kvasinek měřené v suspenzích s distribucí hodnot pHi v populaci individuálních buněk. Experiment provést
pro různé fáze růstu buněčných suspenzí, od raně exponenciální po stacionární.

6. Navrhnout a otestovat protokol průběžného měření pHi kvasinek přímo v kultivačních baňkách pomocí světlovodného adaptéru fluorimetru
Fluoromax3.

7. Ověřit možnost aplikace mikrofluorimetrické metody měření pHi individuálních kvasinek na analýzu vývoje pHi během dělení, včetně
analýzy rozdílů mezi mateřskými a dceřinnými buňkami..

8. Interpretovat získané výsledky v kontextu existujících poznatků o regulaci pHi kvasinek

Seznam odborné literatury

Alberts et al. edit. Molecular Biology of the Cell, 5th edition, Garland Science, New York, 2008; vybrane kapitoly.

Feldmann, H. (2010) Yeast: Molecular and Cell Biology. J. Wiley & Sons, 2010.

Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy, 3rd edition, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York , 2006; vybrané kapitoly

Murphy, D.B., Davidson M.W.: Fundamentals of light microscopy and electronic imaging. 2nd edition, Wiley-Blackwell, Hoboken, New Jersey, 2013.

Vo-Dinh, T. (1981) Synchronous excitation spectroscopy, in Modern Fluorescence Spectroscopy, Vol. 4 (E.C. Wehry, Ed.), Plenum Press, New York, pp. 167-192.

Plášek, J., Melcrová., A, Gášková., D.: Enhanced Sensitivity of pHluorin-Based Monitoring of Intracellular pH Changes Achieved through Synchronously Scanned Fluorescence Spectra. Anal. Chem. 87 (2015) 9600 – 9604.

Plášek, J., Babuka, D., et al.: A novel method for assessment of local pH in periplasmic space and of cell surface potential in yeast. J. Bioenerg. Biomembr.49 (2017) 273–279,


Aktuální časopisecká literatura doporučená vedoucím.

Předběžná náplň práce

Udržování stabilní hodnoty intracelulárního pHi je důležitým aspektem fyziologie kvasinek. Z toho přirozeně vyplývá velký význam spolehlivých metod měření tohoto buněčného parametru. V rámci předcházející diplomové prace A. Melcerové byla vyvinuta a publikována nová metoda měření pHi kvasinek značených fluorescenčním proteinem pHluorinem (A. Melcrová et al., Anal. Chem. 87 (2015) 9600 – 9604). Tato metoda byla v rámci navazující diplomové práci D. Babuky úspěšně použita při studiu acidifikace cytosolu kvasinek vyvolané protonoforem CCCP. Získané výsledky byly již publikovány ve dvou pracích (D. Babuka et al. J. Bioenerg. Biomembr.49 (2017) 273–279; D. Babuka et al. J. Bioenerg. Biomembr.49 (2017) 391-397) a třetí publikace je před dokončením (D. Babuka et. al. Antagonistic Effect of Salts on Weak Acids Food Preservation: Physico-Chemical Background).
Nově vypsaná diplomová práce navazuje na dvě výše uvedené práce s cílem získat informace o distribuci pHi v buněčných populacích s využitím mikrospektrofluorimetrie. V případě úspěšného řešení DP se bude opět jednat o výsledky publikovatelné v mezinárodních odborných časopisech.