Vliv iontu Ca2+ na aktivitu lidské glutamátkarboxypeptidasy II.

• Název práce v češtině: Vliv iontu Ca²⁺ na aktivitu lidské glutamátkarboxypeptidasy II.
• Název v anglickém jazyce: The effect of Ca²⁺ ion on the enzymatic activity of human glutamate carboxypeptidase II
• Klíčová slova: glutamátkarboxypeptidasa II, metaloprotein, Ca₂₊ ion, koordinace iontů
• Klíčová slova anglicky: glutamate carboxypeptidase II, metalloprotein, Ca₂₊ ion, ion coordination
• Akademický rok vypsání: 2016/2017
• Typ práce: bakalářská práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra analytické chemie (31-230)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Cyril Bařinka, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 29.11.2016
• Datum zadání: 29.11.2016
• Datum odevzdání elektronické podoby: 18.05.2017
• Datum proběhlé obhajoby: 08.06.2017
• Oponenti: Mgr. Klára Hlouchová, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Lidská glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, EC 3.4.17.24) je homodimerní membránový glykoprotein, který slouží jako marker rakoviny prostaty a rovněž jako terapeutický cíl léčby neurodegenerativních onemocnění. Extracelulární část GCPII je složená z apikální, proteasové a C-koncové domény. V aktivním místě jsou přítomny dva zinečnaté ionty nezbytné pro enzymatickou aktivitu. V blízkosti dimerizačního rozhraní je pak mezi apikální a proteasovou doménou koordinován ion Ca²⁺, který je od aktivního místa vzdálen 20 Å, a tudíž se pravděpodobně přímo neúčastní hydrolýzy substrátů. Předkládaná práce si klade za cíl objasnit funkci iontu Ca²⁺ v molekule GCPII s využitím kombinace molekulárně-biologických, biochemických a biofyzikálních přístupů. Za tímto účelem jsme připravili sérii rekombinantních proteinů s bodovými mutacemi aminokyselin koordinujících Ca²⁺ ion. Mutantní proteiny byly exprimovány v hmyzích S2 buňkách a purifikovány pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie. Tyto proteiny vykazovaly výrazně sníženou enzymatickou aktivitu, nižší teplotní stabilitu a zvýšenou tendenci k tvorbě nefyziologických agregátů a naopak monomerní formy GCPII. Z výsledků tedy vyplývá, že ion Ca²⁺ hraje zásadní roli pro správné sbalování GCPII a rovněž pro tvorbu homodimerů, které jsou fyziologickou a hydrolyticky aktivní formou tohoto enzymu.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Human glutamate carboxypeptidase II (GCPII, EC 3.4.17.24) is a homodimeric membrane glycoprotein. GCPII has been studied as a marker of prostate carcinoma and a therapeutic target of neurodegenerative disorders. The extracellular region of the protein is composed of three domains, apical, protease and C-terminal. There are two zinc ions in the active site that are essential for the enzymatic activity. A calcium ion is located between apical and protease domains near the dimeric interface approximately 20 Å away from the active site. Consequently, the Ca²⁺ ion in unlikely to participate in substrate hydrolysis. The aim of this thesis is to elucidate the function of Ca²⁺ in GCPII using a combination of molecular-biological, biochemical and biophysical approaches. To this end we prepared series of GCPII variants with mutations in calcium-coordinating amino acids. The mutant constructs were expressed in insect S2 cells and purified by combination of affinity and size exclusion chromatography. Enzymatic activity and thermostability of the mutants were decreased significantly. Furthermore, mutated proteins were aggregation prone and formed a monomeric GCPII species. Our results thus show that Ca²⁺ ion plays an essential role in proper GCPII folding as well as the formation of a homodimer molecule that is physiological and enzymatically active form of the enzyme.