Zánětlivé faktory v celiakii a jejich vliv na monocyty periferní krve

• Název práce v češtině: Zánětlivé faktory v celiakii a jejich vliv na monocyty periferní krve
• Název v anglickém jazyce: Celiac disease-related inflammatory factors and their effect on peripheral blood monocytes
• Akademický rok vypsání: 2016/2017
• Typ práce: diplomová práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra antropologie a genetiky člověka (31-110)
• Vedoucí / školitel: RNDr. Pavlína Daňková, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 21.11.2016
• Datum zadání: 21.11.2016
• Datum odevzdání elektronické podoby: 30.04.2018
• Datum proběhlé obhajoby: 05.06.2018
• Oponenti: Mgr. Pavel Čepek, Ph.D.
• Konzultanti: Mgr. Iva Brynychová

Předběžná náplň práce

Celiakie je orgánově specifické autoimunitní onemocnění, které vzniká ztrátou orální tolerance lepku u geneticky predisponovaných jedinců. U pacientů s neléčenou celiakií vede konzumace lepku k zánětlivé reakci v tenkém střevě, tento zánět se však projeví v celém organismu (např. anemie, osteoporóza, …) a v séru jsou detekovatelné zvýšené hladiny zánětlivých cytokinů např. IFN-γ, TNF-α, IL-6 či prolaktinu (Kapur et al. 2004; Lahat et al. 1999). Tyto cytokiny mají schopnost aktivovat expresi IRF-1(Farber 1992; Fujita et al. 1989), jehož zvýšená exprese byla u pacientů s neléčenou celiakií detekována ve střevní mukose (Salvati et al. 2003). V ní také dochází k rapidní akumulaci CD14⁺CD11c⁺dendritických buněk, přičemž se zdá, že tyto buňky jsou nově rekrutované monocyty (Beitnes et al. 2012). Naše dřívější experimenty naznačily, že markery upregulované ve střevní mukose celiakálních pacientů jsou ve zvýšené míře exprimované i monocyty periferní krve (Brynychova et al. 2016), kde působí auto- a parakrinně; monocyty periferní krve neléčených pacientů se tedy nacházejí v prostředí zvýšených hladin cytokinů.

Cílem diplomové práce je pomocí in vitro kultivace a stimulace vybranými cytokiny (např. IFN-γ, TNF-α, IL-6) ověřit, zda zánětlivé prostředí vede ke zvýšené expresi IRF-1u monocytární linie THP1 a u monocytů zdravých lidí i pacientů s celiakií (recentních, neléčených, ale i těch dodržujících bezlepkovou dietu minimálně 1 rok). Mononukleární buňky budou z krve izolovány pomocí gradientové centrifugace přes Ficoll a monocyty budou separovány pomocí adheze. Exprese mRNA genu IRF-1 bude detekována pomocí kvantitativní PCR v reálném čase. Diplomová práce zmapuje účinky vybraných zánětlivých cytokinů na expresi IRF-1u zdravých subjektů a pacientů s celiakií a pokusí se odhalit, k jakým důsledkům zvýšená exprese IRF-1 může vést, čímž přispěje k objasnění role IRF-1v patogenezi celiakie.

Výsledky pilotních experimentů, kdy byl sledován vliv zánětlivého prostředí na THP1 buněčnou linii, naznačují schopnost těchto buněk reagovat na zánětlivé prostředí zvýšenou expresí IRF-1. Bylo však pozorováno, že exprese IRF-1 je buněčně specifická a závislá na typu stimulu – např. při stimulaci prolaktinem byla exprese IRF-1 pozorována u granulocytů, avšak ne u mononukleárních buněk v krvi (Dogusan et al. 2001) a v našich experimentech ani u primárních monocytů samotných.

V případě, že některý z cytokinů povede u primokultur monocytů ke zvýšené expresi IRF-1, bude DP prostřednictvím detekce markerů buněčné diferenciace (ODC) či buněčné smrti (CD95) sledovat, jaké důsledky pro monocyty zvýšená hladina IRF-1 má. Navíc, pokud bude expresi IRF-1 zvyšovat cytokin TNF-α, bude ověřen inhibiční vliv prolaktinu na tuto signální dráhu. Na základě našich předběžných dat se zdá, že prolaktin u monocytů nevede k aktivaci exprese IRF-1 přes JAK/Stat-1 signální dráhu, ale spíše vede k fosforylaci Stat-5, který expresi IRF-1 inhibuje a zároveň má schopnost blokovat její aktivaci pomocí NF‑κB indukovaného TNF-α (Yu-Lee 2002).

Beitnes ACR, Raki M, Brottveit M, Lundin KEA, Jahnsen FL, and Sollid LM. 2012. Rapid Accumulation of CD14(+)CD11c(+) Dendritic Cells in Gut Mucosa of Celiac Disease after in vivo Gluten Challenge. PLoS One 7(3).
Brynychova I, Hoffmanova I, Dvorak M, Dankova P. 2016. Increased Expression of TLR4 and TLR7 but Not Prolactin mRNA by Peripheral Blood Monocytes in Active Celiac Disease. Adv Clin Exp Med 25 (5): 887 - 893
Dogusan Z, Hooghe R, Verdood P, and Hooghe-Peters EL. 2001. Cytokine-like effects of prolactin in human mononuclear and polymorphonuclear leukocytes. J Neuroimmunol 120(1-2):58-66.
Farber JM. 1992. A COLLECTION OF MESSENGER-RNA SPECIES THAT ARE INDUCIBLE IN THE RAW-264.7 MOUSE MACROPHAGE CELL-LINE BY GAMMA INTERFERON AND OTHER AGENTS. Molecular and Cellular Biology 12(4):1535-1545.
Fujita T, Reis LFL, Watanabe N, Kimura Y, Taniguchi T, and Vilcek J. 1989. INDUCTION OF THE TRANSCRIPTION FACTOR IRF-1 AND INTERFERON-BETA MESSENGER-RNAS BY CYTOKINES AND ACTIVATORS OF 2ND-MESSENGER PATHWAYS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86(24):9936-9940.
Kapur G, Patwari AK, Narayan S, and Anand VK. 2004. Serum prolactin in celiac disease. J Trop Pediatr 50(1):37-40.
Lahat N, Shapiro S, Karban A, Gerstein R, Kinarty A, and Lerner A. 1999. Cytokine profile in coeliac disease. Scandinavian Journal of Immunology 49(4):441-446.
Salvati VM, MacDonald TT, Blanco GD, Mazzarella G, Monteleone I, Vavassori P, Auricchio S, Pallone F, Troncone R, and Monteleone G. 2003. Enhanced expression of interferon regulatory factor-1 in the mucosa of children with celiac disease. Pediatric Research 54(3):312-318.
Yu-Lee LY. 2002. Prolactin modulation of immune and inflammatory responses. Recent Progress in Hormone Research, Vol 57 57:435-455.