Anaerobic ciliates as a model group for studying the biodiversity and symbioses in anoxic environments

• Název práce v češtině: Anaerobní nálevníci jako modelová skupina pro studiu biodiverzity a symbióz v anoxických prostředích
• Název v anglickém jazyce: Anaerobic ciliates as a model group for studying the biodiversity and symbioses in anoxic environments
• Klíčová slova: anaerobióza, anaerobní nálevníci, fylogenomika, MRO, metabolismus, symbiózy
• Klíčová slova anglicky: anaerobiosis, anaerobic ciliates, phylogenomics, MROs, metabolism, symbioses
• Akademický rok vypsání: 2015/2016
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Katedra zoologie (31-170)
• Vedoucí / školitel: prof. RNDr. Ivan Čepička, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 23.10.2015
• Datum zadání: 23.10.2015
• Datum odevzdání elektronické podoby: 28.05.2020
• Datum proběhlé obhajoby: 02.07.2020
• Oponenti: Eleni Gentekaki, Dr.

Předběžná náplň práce

Nálevníci (Ciliophora) jsou bezesporu nejznámější a nejstudovanější prvoci. Také jsou širokou veřejností vnímáni jako prvoci nejvíce podobní živočichům, i když jim nejsou vůbec příbuzní. Jedná se o velice diverzifikovanou skupinu, jejíž zástupci, mimo jiné, obývají různá extrémní prostředí včetně anoxických sedimentů. Jako v případě jiných volně žijících anaerobních prvoků, jsou anaerobní nálevníci výzkumníky nespravedlivě opomíjeni, přitom se jedná o dosti zajímavé organismy. Je známo, že k anaerobnímu způsobu života přešli nálevníci nejméně šestkrát nezávisle na sobě a že mitochondrie anaerobních nálevníků byly přeměněny na vodík produkující hydrogenosomy. Řada anaerobních nálevníků hostí pestrou škálu endo- a ektosymbiotických prokaryot. Nejznámější takoví symbionti jsou methanogenní archebakterie, které zpracovávají vodík produkovaný hydrogenosomy a produkují methan; i když jsou to významní producenti tohoto skleníkového plynu, o jejich hostitelské specifitě či životě v buňkách nálevníků není známo téměř nic.
Hlavní překážkou studia anaerobních nálevníků je nedostatek laboratorních kultur. Z většiny linií dokonce není v současné době pro veřejnost k dispozici dokonce ani jedna kultura. Johana Rotterová během svého magisterského projektu (PřF UK, obor Protistologie) vytvořila rozsáhlou sbírku kultur anaerobních nálevníků (zdaleka největší na světě – obsahuje více než 100 izolátů patřící více než 35 druhů) a jednotlivé izoláty předběžně charakterizovala pomocí světelné mikroskopie a sekvencí 18S rDNA. Zjistila také, že si nálevníci v jejich kulturách drží své endo- a ektosymbionty i po několika letech laboratorní kultivace. Také objevila novou linii anaerobních nálevníků, nejspíše půjde o novou třídu. Tato sbírka kultur jí tedy dává do ruky silný nástroj ke studiu různých aspektů života anaerobních nálevníků.
Cíle doktorského projektu J. Rotterové jsou:
(1) Dokončit morfologickou charakterizaci kultivovaných anaerobních nálevníků skupin Armophorea, Scuticociliatia a nově objevené linie („Muranea“). Na základě získaných dat a fylogenetické analýzy založené na 18S rDNA provést taxonomickou revizi těchto linií (a formálně popsat linii Muranea). Na tomto tématu již J. Rotterová spolupracuje s Dr, W. Bourlandem, jedním z mála současných znalců diverzity anaerobních nálevníků (Boise University, Idaho, USA).
(1) Osekvenovat transkriptomy několika (3 – 5, podle dostupných financí) anaerobních nálevníků představujících hluboké linie a provést fylogenomickou analýzu založenou přibližně na 130 genech. Výsledky by měly vést k přesnějším odhadům počtů nezávislého vzniku anaerobiózy u nálevníků a určit fylogenetickou pozici linie Muranea.
(4) Transkriptomická data budou použita k charakterizaci mitochondriálního metabolismu jednotlivých linií anaerobních nálevníků. Lze předpokládat, že míra redukce mitochondrie a přizpůsobení se anoxickým podmínkám se bude u jednotlivých linií lišit. V současnosti jsou však k dispozici pouze data získaná z jediného druhu.
(5) Studium symbiotických prokaryot a jejich hostitelské specifity. Bude sekvenována 16S rDNA ekto- i endosymbiontů z několika desítek izolátů různých anaerobních izolátů a složení symbiontů bude porovnáno napříč druhy. Lokalizace symbiontů na buňkách/v buňkách nálevníků bude studována pomocí transmisní a skenovací elektronové mikroskopie. Přítomnost methanogenních archebakterií bude potvrzena pomocí charakteristické autofluorescence a pomocí FISH se specifickými sondami.
Metodika projektu zahrnuje mikrobiologické, morfologické, ultrastrukturní, pokročilé molekulárně-biologické a molekulárně-fylogenetické metody a základní buněčně-biologické metody (FISH). Většinu z nich Johana Rotterová zvládla již během svého magisterského studia, ty ostatní (FISH, fylogenomická analýza, mikromanipulace s buňkami nálevníků) si osvojí během svého doktorského studia s pomocí kolegů z laboratoře i externích spolupracovníků. Spektrum jí používaných metod by měla výrazně obohatit plánovaná tříměsíční vědecká stáž na spolupracujícím pracovišti Dr. Virginie Edgcomb (Woods Hole Oceanographic Institution, Massachussets, USA).

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

The overall aim of the project is to considerably expand our understanding of the evolution
of ciliates and microbial symbioses in oxygen-depleted environments using modern
molecular methods. This would not be possible without expanding our insight into
the biodiversity and phylogeny of the understudied yet ecologically important anaerobic
ciliates and their prokaryotic symbionts that together play crucial role in anoxic ecosystems.
The particular aims of the doctoral project of J. Rotterova are:

1) Phylogenomic analysis of ciliates including free-living anaerobes and using newly
generated data. Sequencing the transcriptomes and genomes of several deepbranching
lineages of anaerobic ciliates for a phylogenomic analysis based on
approximately 150 genes to elucidate the evolution of anaerobiosis in ciliates and gain
means for more accurate estimates of the numbers of independent anaerobiosis origins
in ciliates.
2) Taxonomic revision of anaerobic ciliates within SAL group with emphasis on
Metopida. Mapping the diversity of anaerobic ciliates within SAL group, expanding
and maintaining the culture collection of hundreds of free-living anaerobic ciliates
(freshwater, marine, and brackish) isolated from anoxic sediments worldwide,
analyzing the phylogenetic relationships within particular lineages using 18S
rRNA gene sequences, and performing morphological characterization of cultivated
anaerobic ciliates of various Metopida and newly discovered lineages within SAL
clade. Formal description of newly discovered taxa.
3) In silico prediction of pathways of energetic metabolism. Using transcriptomic
and metagenomic data to characterize mitochondrial metabolism of individual
anaerobic ciliate lineages and deepen our knowledge of the evolution of anaerobiosis
in ciliates.
3) Research of symbiotic methanogenic Archaea and unidentified bacteria associated
with anaerobic ciliates, their identification and host-specificity, using methods
of amplicon 16S rRNA gene and metagenomic sequencing, localization of symbionts
on or within a host cell will be studied by transmission and scanning electron
microscopy and CARD-FISH with group-specific probes.