Myší receptor Klrb1b se strukturně řadí do rodiny proteinů podobných lektinům C-typu a je exprimován na povrchu NK buněk a subpopulaci T buněk. Nejnovější studie ukazují na jeho možnou interakci s molekulou Clr-b, která vede k inhibici cytotoxické aktivity NK buněk. Vzhledem k tomu, že příslušná interakce byla popsána nepřímo a jakákoliv experimentální strukturní data o příslušném receptoru chybí, projekt bude rozložen do několika paralelních úrovní. V jedné časti se bude celá extracelulární část a ligand vázající doména receptoru Klrb1b exprimovat heterologně v E. coli, obě formy budou in vitro sbaleny a dále strukturně charakterizovány rentgen-strukturní analýzou a strukturní hmotnostní spektrometrii. V druhé rovině projektu budou obě in vitro sbalené formy proteinu fluorescenčně značeny a bude sledována jejich vazba na buňky sleziny, lymfatických uzlin a kostní dřeně fluorescenční a konfokální mikroskopii. Třetí část projektu bude zaměřena na dynamiku receptoru v buněčné membráně. Za tímto účelem bude připraven fúzní konstrukt (Klrb1b receptor s sGFP), vzniklým konstruktem budou transfekovány vybrané linie savčích buněk, nakonec se bude s využitím časově rozlišené fluorescence a zhášení fluorescence sledovat transport proteinu na buněčnou membránu, jeho případná dimerizace a recyklační endocytóza.
Předběžná náplň práce v anglickém jazyce
The murine receptor Klrb1b structurally belong to a family of proteins similar to the C-type lectins and is expressed on the surface of NK cells and a subpopulation of T cells. Recent studies suggest its possible interaction with the molecule Clr-b, which leads to inhibition of NK cell cytotoxic activity. Given that the relevant interactions have been described indirectly and any relevant experimental structure data are missing, the project is divided into several parallel levels. In one part, the entire extracellular portion and ligand binding domain of the receptor Klrb1b will be heterologously expressed in E. coli, both forms will be packaged in vitro and structurally characterized by X-ray structural analysis and the structural mass spectrometry. The second level of the project, both in vitro folded proteins will be fluorescently labeled and monitored their binding to cells of the spleen, lymph nodes and bone marrow by fluorescence and confocal microscopy. The third part of the project will focus on the dynamics of the receptor in the cell membrane. For this purpose, the fusion construct (Klrb1b receptor sGFP) will be prepared and resulting constructs will be transfected into selected mammalian cell line. Ultimately the protein transport to the cell membrane, its potential dimerization, endocytosis and recycling will be monitored using time-resolved fluorescence and fluorescence quenching.
- zadáno a potvrzeno stud. odd.