Eukaryotická iniciace translace je vysoce komplexní proces zahrnující celou řadu fází. Iniciace translace je zahájena sestavením preiniciačního komplexu 43S, který nasedá na 5’ čepičku mRNA a následně pročítá mRNA za účelem rozpoznání vhodného AUG start kodónu. Po rozeznání AUG kodónu většina iniciačních faktorů z komplexu 48S disociuje. Některé z těchto faktorů nicméně zůstávají s komplexem 48S přechodně asociované, jedná se například o eIF3 a nejspíše o eIF4G. V rámci této práce jsme vyvinuli metodu RNA–protein Ni2+-pull down (Rap-Nip), která slouží k in vivo detekci fragmentů mRNA navázaných na eIF3 v kvasinkách. Ukázali jsme, že eIF3 kvasinky Saccharomyces cerevisiae zůstává po iniciaci translace perzistentně navázán na elongujících ribozomech po dobu několika elongačních cyklů. eIF3 navíc stabilizuje post-terminační komplex 40S na stop kodónu krátkých čtecích rámců uORF1 a uORF2 GCN4 a to prostřednictvím kontaktu mezi N-terminální částí podjednotky a/TIF32 a elementy podporujícími reiniciaci (RPEs) příslušného uORF GCN4. S využitím β‑galaktosidázového reportérového systému jsme odhalili, že AU-bohatý motiv (motiv AU1‑2A/ UUAU2) nacházející se těsně za stop kodonem reiniciačně (REI)-permisivních uORFs podporuje autonomně a místně specificky reiniciaci. Rovněž jsme ukázali, že přesná délka REI-permisivního uORF a také poslední kódující triplet těchto uORF jsou pro reiniciační aktivitu zásadní. Nakonec jsme analyzovali vliv kódujících tripletů a tetranukleotidů stop kodónů uORFs GCN4. Z naší analýzy vyplynula negativní korelace mezi účinností reiniciace a terminace translace. V další studii jsme se zaměřili na strukturu 5´ úseku uORF1 lidského ATF4, kterou jsme modelovali in silico. Model odhalil strukturní podobnosti ATF4 s RPE elementy ii. a iv. GCN4 (konkrétně se jedná o 5’ vlásenku s třemi vnitřními smyčkami a stonek vlásenky v 3´ části modelovaného úseku ATF4). Tato struktura podporuje REI ATF4. Zdá se, že zmíněné struktury jsou navíc alespoň mezi savci velmi dobře konzervovány. Zajímavé je, že na rozdíl od kvasinek lidská podjednotka eIF3a nemá na REI vliv. Naše data nicméně odhalila, že u lidí má pozitivní vliv na míru REI podjednotka eIF3h. Pomocí metody chemického zesíťování a spojené s hmotnostní spektrometrií jsme ukázali, že se volná forma eIF3 S. cerevisiae vyznačuje konformací s těsně sbalenými doménami. Tato kompaktní architektura eIF3 je navíc dále upevněna vazbou faktorů eIF1 a eIF5. Naše analýza naznačuje, že první kontakt eIF3 s cytosolickou stranou 40S zajišťuje N-terminální doména podjednotky a/TIF32 spolu s C-terminální doménou podjednotky c/NIP1. Z našich dat vyplývá, že eIF3 S. cerevisiae se pohybuje v rámci krátkých uORF navázaný na elongujících ribozomech a stabilizuje posterminační komplex mRNA-eIF3-40S na stop kodonech REI-permisivních uORFs, čímž podporuje reiniciaci. Naše data poskytují komplexní přehled všech cis-determinantů REI a jejich efektů v kontextu translační kontroly GCN4. Naše data dále naznačují, že molekulární podstata mechanismu REI je mezi kvasinkami a lidmi konzervována. Analýza dat získaných chemickým zesíťováním naznačuje, že eIF3 interaguje s cytosolickou stranou 40S ribosomální podjednotky takovým způsobem, že po prvotním kontaktu dochází k rozvinutí a roztažení eIF3, který se následně ovine kolem hlavy 40S a ovlivňuje téměř všechny kroky iniciace translace.
Předběžná náplň práce v anglickém jazyce
Eukaryotic translation initiation is a complex multi-step process. It begins with the formation of 43S pre-initiation complex (PIC), which binds to the 5’ cap of the mRNA, scans downstream searching for an appropriate AUG start site. Upon AUG recognition by 48S PIC, most of the initiation factors dissociate. However, some initiation factors, such as eIF3 and may be eIF4G, remain transiently associated with the 48S PIC. Here, we have developed a yeast in vivo RNA–Protein Ni2+-Pull down (Rap-Nip) assay for in vivo detection of eIF3 bound mRNA fragments. In Saccharomyces cerevisiae, we demonstrated showing that, after initiation, eIF3 persistently associated with the elongating ribosomes for few elongation cycles. Further, it stabilizes the post-termination 40S complex on the stop codon of both uORF1 and 2 by establishing a contact between the N-terminal domain of a/TIF32 subunit and the Reinitiation Promoting Elements (RPEs) of corresponding uORFs on GCN4. Furthermore, employing the β-galactosidase reporter assays we revealed that AU-rich motif (AU1-2A/ UUAU2 motif) that occurs immediately following the stop codon of reinitiation (REI)-permissive uORFs promotes REI in position-specific autonomous fashion. We also have shown that the exact length and the last coding triplet of the REI-permissive uORF are critical for its REI activity. Finally, we analyzed the contributions of coding triplets and the stop codon tetranucleotides of GCN4 uORFs showing a negative correlation between the efficiency of REI and efficiency of translation termination. In the next study, we analyzed in silico modeling of the entire 5’ sequence of human ATF4-uORF1, revealed the structural features (5’ triple-circle hairpin and a 3’ stem loop) resemble similar structures representing GCN4’s RPEs ii. and iv. promote REI of ATF4. They also seem to be very well conserved at least among other mammalian species. Moreover, our data revealed that interestingly the human eIF3h, but not eIF3a as in yeast, promotes REI. Finally, employing the chemical crosslinking coupled with advanced mass spectrometry we demonstrated that S. cerevisiae eIF3 domains are tightly packed in the ribosome-free form. The compact architecture of eIF3 is further fortified by eIF1 and eIF5. Further, our analysis suggests that a/TIF32-NTD and c/NIP1-CTD makes the initial contact with the 40S solvent-exposed side. Together, our data suggests that in S. cerevisiae, eIF3 travels with the elongating ribosomes on short uORFs and stabilize the mRNA-eIF3-40S post-termination complex on stop codon of REI-permissive uORFs to promote REI downstream. Further, we provide a complex overview of all cis-determinants of REI with their effects set in the context of the overall GCN4 translational control. Furthermore, our data also suggests that the basics of molecular mechanism of REI are conserved between yeast and humans, however, it could be more complex in higher organisms. Finally, our crosslinking analysis suggests that eIF3’s initial contact with the 40S solvent-exposed side makes eIF3 to open up and wrap around the 40S head with its extended arms to control almost all the initiation events.
- zadáno vedoucím/školitelem