Kultivace kmenových buněk zubní pulpy v kultivačním médiu bez xenogenních látek

• Název práce v češtině: Kultivace kmenových buněk zubní pulpy v kultivačním médiu bez xenogenních látek
• Název v anglickém jazyce: Human Dental Pulp Stem Cells Cultured in Xenogeneic-Free Supplemented Media
• Klíčová slova: Mezenchymální kmenové buňky, zubní dřeň, lidské krevní deriváty, kultivace.
• Klíčová slova anglicky: Mesenchymal stem cells, dental pulp, human blood derivatives, cultivation.
• Akademický rok vypsání: 2012/2013
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Stomatologická klinika (15-550)
• Vedoucí / školitel: MDDr. Nela Jouklová, Ph.D.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem
• Datum přihlášení: 31.01.2013
• Datum zadání: 31.01.2013
• Datum a čas obhajoby: 27.09.2023 13:00
• Datum odevzdání elektronické podoby: 14.05.2023
• Datum odevzdání tištěné podoby: 26.05.2023
• Datum proběhlé obhajoby: 27.09.2023
• Oponenti: prof. MUDr. Vlasta Merglová, CSc.

Předběžná náplň práce

Kultivace kmenových buněk zubní pulpy v kultivačním médiu bez xenogenních látek
Souhrn
Úvod: Tématem předkládané studie je kultivace kmenových buněk zubní pulpy (hDPSCs) v kultivačním médiu bez xenogenních komponent. Není přípustné, aby byly v klinické praxi používány buňky, které proliferovaly pod vlivem xenogenních (mimodruhových) látek. V případě hDPSCs se jedná především o fetální telecí sérum (FCS). Přestože jsou tyto suplementy považovány za zlatý standard kultivace mezenchymálních kmenových buněk (hMSCs) a vlastnosti s nimi kultivovaných buněk byly postulovány jako charakteristické a určující vlastnosti jednotlivých linií hMSCs. Tím vyvstává základní otázka, pokud a jak ovlivňují xenogenní krevní deriváty vlastnosti buněk a jejich růstové charakteristiky. Existují dvě možnosti náhrady těchto látek jako komplexů růstových faktorů, kdy jsou do média přidány pouze definované růstové faktory tzv. bezsérová média, nebo náhrada zvířecích krevních doplňků lidskými, ideálně autologními. Cílem provedeného výzkumu bylo pomoci ozřejmit odpovědi na tyto otázky, které jsou základní pro buněčnou terapii a zavedení do lékařské praxe.
Metodika: Kultivací 12 linií hDPSCs ze stálých, dočasných a natálních zubů ve 12 různých médiích jsme zjišťovali vliv FCS, derivátů lidské krve krevní plazmy (HP) a na destičky bohaté krevní plazmy (PRP) o různých koncentracích (2%, 10%, 20%) na pěstované buňky pomocí růstových charakteristik a fenotypové analýzy. Nejprve byly všechny linie kultivovány do 15. pasáže za standardních kultivačních podmínek a diferencovány v osteogenní, chondrogenní a adipogenní buněčnou linii k průkazu kmenovosti.
Výsledky: Dle výsledků této studie je krevní derivát s nejvyšší podporou růstu PRP v 10% koncentraci pro kmenové buňky zubní dřeně stálých zubů (hADPSCs) a natálních zubů (hNDPSCs). Kmenové buňky zubní dřeně dočasných zubů (hDDPSCs) nejlépe rostly v médiu s 10% koncentrací HP. Fenotypová analýza prokázala pozoruhodné rozdíly v expresi povrchových markerů, kdy buňky kultivované v médiích s deriváty lidské krve vykazovaly vyšší neurogenní potenciál a fenotyp bližší embryonálním kmenovým buňkám (hESCs), zatímco buňky kultivované s FCS vyšší tendenci k expresi znaků hematopoetické řady bližší progenitorovým buňkám.
Závěr: V naší studii jsme prokázali vliv druhu krevní náhražky na fenotyp hDPSCs s tím, že lidské krevní deriváty o 10% koncentraci jsou ideální náhradou FCS, nejen s ohledem na proliferační aktivitu, ale především na udržení nediferencovaného stavu a neurogenního potenciálu.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Human dental pulp stem cells cultured in xenogeneic-free supplemented media
Summary
Introduction: The topic of the study is the cultivation of dental pulp stem cells (hDPSCs) in a xenogeneic-free culture medium. It is not permissible to use cells upon growing under the influence of xenogeneic (extraneous) substances in human clinical practice. The most frequently used in cultivation of hDPSCs is fetal calf serum (FCS/FBS). Unfortunately, these supplements are widespread in hMSCs cultivation, and all gold standard hMSCs properties were postulated in cells cultivated using these supplements. This raises the basic question if and how xenogeneic blood derivatives affect the properties of cells and their growth characteristics. There are two options for replacing these xenogeneic substances in the culture medium: the so-called serum-free media, or human blood supplements, ideally autologous ones. The conducted research was aimed at identifying the effects of xenogeneic and human blood supplements on basic hDPSCs characteristics that are fundamental to introduce the cell therapy into regular medical practice.
Method: By culturing 12 hDPSC lines obtained from adult, deciduous, and natal teeth in 12 different culture media, we investigated the effect of FCS, human blood derivatives, i.e., blood plasma (HP), and platelet-rich blood plasma (PRP) of different concentrations (2%, 10%, 20%) on cultured cells using growth characteristics and phenotypic analysis. First, all lines were cultured up to the 15th passage under standard culture conditions and differentiated into osteogenic, chondrogenic, and adipogenic cell lines to demonstrate stemness.
Results: According to the results of this study, the blood derivative with the highest growth support for dental pulp stem cells of permanent teeth (hADPSCs) and natal teeth (hNDPSCs) is PRP at the concentration of 10%. hDDPSCs grew best in cultivation medium with 10% HP. Phenotypic analysis showed remarkable differences in the expression of cluster of differentiation markers. Cells cultured in media with human blood derivatives have the higher neurogenic potential and a phenotype resembling the embryonic stem cells (hESCs), while cells cultured with FCS tended to express features of the hematopoietic lineage resembling the progenitor cells.
Conclusion: In our study, we demonstrated the effect of the various types of blood substitutes on the hDPSCs proliferation rate and phenotype. The human blood derivatives at the concentration of 10% are an ideal substitute for FCS due to their positive effect on hDPSCs proliferative activity, and support hDPSCs the undifferentiated state and neurogenic potential.