Rhomboid family intramembrane proteases in prokaryotes: mechanism, substrate repertoires and biological functions in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis.
Název práce v češtině:
Intramembránové proteasy z rodiny rhomboidů v prokaryotech: mechanismus, repertoáry substrátů a biologické funkce u Gram-positivní bakterie Bacillus subtilis.
Název v anglickém jazyce:
Rhomboid family intramembrane proteases in prokaryotes: mechanism, substrate repertoires and biological functions in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis.
Proteasy rodiny rhomboidů jsou rozšířeny u všech organismů a je známo, že u eukaryot regulují řadu důležitých biologických procesů, jako např. mezibuněčnou signalizaci, mitochondriální dynamiku nebo se uplatňují při kontrole kvality membránových proteinů. Jejich role v prokaryotech jsou téměř neznámé s výjimkou jediného případu, kdy v gram-negativní bakterii Providencia stuartii rhomboid aktivuje twin-arginin translokasu a tím reguluje aktivitu chabě popsaného quorum sensing systému. Cílem disertační práce bude lépe pochopit funkce rhomboidů v prokaryotech. Soustředíme se na modelovou Gram-positivní bakterii Bacillus subtilis. Charakterizujeme repertoár substrátů jejich rhomboidů YqgP a YdcA, analyzujeme jejich substrátovou specifitu a pokusíme se zjistit jejich biologickou roli. Předběžné výsledky naznačují, že aktivita YqgP je nutná k adaptaci na stres způsobený vysokým pH a přispívá rovněž k resistenci vůči norfloxacinu (Stříšovský & Freeman, nepublikováno). Literární prameny dále naznačují, že delece genu yqgP ovlivňuje transport glukosy přes buněčnou membránu a vede k defektům při buněčném dělení. V pozadí těchto fenotypů velmi pravděpodobně stojí defekt processingu přirozených substrátů YqgP. Tyto substráty se pokusíme nalézt pomocí biochemického screeningu membránového subproteomu B.subtilis a také se pokusíme vyvinout metody pro jejich identifikaci založené na kvantitativní proteomice. Nalezené substráty validujeme na endogenní úrovni v B.subtilis pomocí epitopového značení v genomu. Roli rhomboidů a jejich substrátů ve výše zmíněných procesech pak budeme studovat metodami biochemickými i genetickými s využitím bohatých zdrojů informací i nástrojů veřejně dostupných pro B.subtilis. Jelikož oba rhomboidy B.subtilis mají orthology v Gram-pozitivních pathogenech jako jsou Listeria monocytogenes nebo Bacillus anthracis, pochopení jejich funkce v B.subtilis bude prvním krokem ke studiu jejich významu pro biologii vybraných pathogenů. Po metodické stránce bude práce zahrnovat metody moderní molekulární biologie a biochemie: klonování rekombinantní DNA, heterologní overexpresi membránových proteinů v E.coli, jejich purifikaci a charakterisaci, enzymová stanovení a reversní genetiku v B.subtilis.
Předběžná náplň práce v anglickém jazyce
Intramembrane proteases of the rhomboid family are found in virtually all organisms. In eukaryotes they regulate a number of important biological processes, such as intercellular signalling, mitochondrial dynamics and membrane protein quality control. Their roles in prokaryotes are unknown but for one example. A rhomboid protease of the Gram-negative bacterium Providencia stuartii is required for the biogenesis of the twin-arginine translocase that activates a poorly characterised quorum sensing system. The aim of the dissertation is to increase our understanding of the functions of prokaryotic rhomboid proteases. Focusing of the major model Gram-positive bacterium Bacillus subtilis, we will characterise the substrate repertoire of its two rhomboid proteases, YqgP and YdcA, analyse their substrate specificity and identify their biological roles. Preliminary data suggest that the activity of YqgP is required for the adaptation to alkaline stress and contributes to the resistance to norfloxacin antibiotic by an unknown mechanism (Strisovsky & Freeman, unpublished). Published reports also indicate that the deletion of yqgP impacts on the transport of glucose across the cellular membrane and causes cell division defects. These phenotypes are most likely caused by a defect in the processing of YqgP substrates. To understand the molecular details of these phenotypes and the role of YqgP, we will identify its substrates in an in vitro biochemical screen of a defined membrane subproteome and will try to develop methods for substrate identification based on quantitative proteomics. The identified substrates will be validated at endogenous levels in B.subtilis using epitope tagging. The roles of rhomboids and their identified substrates in the above-mentioned processes will be studied by genetic and biochemical methods taking advantage of the ample collection of tools and information publicly available for B. subtilis. Since both B.subtilis rhomboids have orthologs in Gram-positive pathogens such as Listeria monocytogenes and Bacillus anthracis, understanding their functions in B.subtilis will be the first step towards investigating their roles in the biology of pathogens. Technically, the work will employ methods of modern molecular biology and biochemistry: cloning of recombinant DNA, heterologous overexpression of membrane proteins in E.coli, their purification and characterisation, enzymatic assays and reverse genetics in B. subtilis.
- zadáno vedoucím/školitelem