Exprese a purifikace N-koncové části filamentózního hemaglutininu z Bordetella Pertussis v E. Coli

• Název práce v češtině: Exprese a purifikace N-koncové části filamentózního hemaglutininu z Bordetella Pertussis v E. Coli
• Název v anglickém jazyce: Expression and purification of N-terminal fragment of filamentous hemagglutinin from Bordetella Pertussis in E. Coli
• Klíčová slova: Bordetella pertussis, Escherichia coli, filamentózní hemaglutinin
• Klíčová slova anglicky: Bordetella pertussis, Escherichia coli, filamentous hemagglutinin
• Akademický rok vypsání: 2011/2012
• Typ práce: bakalářská práce
• Jazyk práce: čeština
• Ústav: Katedra biochemie (31-250)
• Vedoucí / školitel: prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc.
• Řešitel: skrytý - zadáno vedoucím/školitelem, čeká na schválení garantem
• Datum přihlášení: 29.10.2011
• Datum zadání: 06.12.2011
• Datum odevzdání elektronické podoby: 26.05.2013
• Datum proběhlé obhajoby: 10.06.2013
• Oponenti: RNDr. Daniel Kavan, Ph.D.
• Konzultanti: Mgr. Ladislav Bumba, Ph.D.

Předběžná náplň práce

Černý kašel je vysoce nakažlivé onemocnění způsobené gramnegativní bakterií Bordetella pertussis. V průběhu infekce bakterie produkuje celou řadu toxinů a adhezivních molekul, mezi něž patří i filamentózní hemaglutinin (FHA). FHA je 220 kDa povrchový protein, jenž je také produkován ve velkém množství do média, a hraje klíčovou úlohu v interakci mezi bakterií a hostitelskými buňkami. Cílem této práce bylo vytvořit heterologní expresní systém na produkci N-koncové části B. pertussis FHA (FHA1-862) v buňkách Escherichia coli. Pro sekreci proteinu FHA1-862 do media byl vytvořen plasmid skládající se ze systému dvou nezávislých T7/Lac promotorů, první pro gen fhaB kódující FHA1-862, a druhý pro gen fhaC kódující transportní protein, jenž umožňuje přenos FHA z periplasmatického prostoru do extracelulárního média. Protein byl úspěšně sekretován v buňkách E. coli BL21 nesoucí plasmid pMM100 (LacI^q) při 30 °C a přečištěn pomocí afinitní kapalinové chromatografie na nosiči Cellufine. Tyto výsledky naznačují, že protein FHA862 může být produkován expresním systémem E. coli, nicméně tento systém poskytuje malou výtěžnost proteinu.

Předběžná náplň práce v anglickém jazyce

Whooping cough is highly contagious disease caused by gram-negative bacteria Bordetella pertussis. During infection the bacteria produces many types of toxins and adhesive molecules including a filamentous hemagglutinin(FHA). FHA is 220 kDa surface-exposed and secreted protein, which plays a key role in host-cell interactions. The project aims at construction of heterologous expression system for production of the N-terminal part of B. pertussis FHA (FHA1-862) in E. coli. The expression vector is composed of system of two independent T7/Lac promoters and enables secretion of FHA1-862 into the culture media. Downstream of the first promoter is fhaB gene encoding FHA1-862 and the letter is followed by fhaC gen encoding the FhaC transport protein, which allows translocation of FHA from periplasmic space to extracellular milieu. FHA1-862 was successfully secreted in E. coli strain BL21 carrying plasmid pMM100 (Laclq) at 30 °C and purified by affinity chromatography on Cellufine resin. These results indicate that FHA1-862 protein can be produced in E. coli, however, the system is inefficient and the yield of the protein is very low.