Characterization of native and heterologously expressed membrane transporters in yeast using fluorescent probes

• Název práce v češtině: Charakterizace vlastností nativních a heterologně exprimovaných membránových transportérů u kvasinek pomocí fluorescenčních sond
• Název v anglickém jazyce: Characterization of native and heterologously expressed membrane transporters in yeast using fluorescent probes
• Klíčová slova: alkoholy, diS-C3(3) fluorescenční metoda, membránový potenciál, mnohočetná léková rezistence, draslík
• Klíčová slova anglicky: alcohols, diS-C3(3) fluorescence assay, membrane potential, multidrug resistance, potassium
• Akademický rok vypsání: 2011/2012
• Typ práce: disertační práce
• Jazyk práce: angličtina
• Ústav: Fyzikální ústav UK (32-FUUK)
• Vedoucí / školitel: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.
• Řešitel: skrytý - zadáno a potvrzeno stud. odd.
• Datum přihlášení: 26.09.2011
• Datum zadání: 26.09.2011
• Datum potvrzení stud. oddělením: 29.12.2011
• Datum a čas obhajoby: 24.08.2017 09:00
• Datum odevzdání elektronické podoby: 03.07.2017
• Datum odevzdání tištěné podoby: 03.07.2017
• Datum proběhlé obhajoby: 24.08.2017
• Oponenti: Mgr. Marek Cebecauer, Ph.D.
• Konzultanti: Ing. Karel Sigler, DrSc.

Zásady pro vypracování

Hlavním cílem disertační práce je podrobné a systematické studium vlastností nativních a heterologně exprimovaných membránových transportérů u kvasinek Saccharomyces cerevisiae pomocí potenciometrických fluorescenčních sond (zejména diS-C3(3)), které mohou být substráty MDR pump. Fluorescenční měření budou prováděna na setu isogenních mutantních kmenů (tj. deletovaných v genech kódujících některé z MDR pump, nebo naopak s nadprodukcí těchto pump, a rovněž s heterologně exprimovanými geny z jiných kvasinek).
Práce má převážně experimentální charakter. Metodicky je zabezpečena na Fyzikálním ústavu UK, získání biologického materiálu a provádění biologických testů je zajištěno v rámci spolupráce s Mikrobiologickým a Fyziologickým ústavem AVČR.

Seznam odborné literatury

1. B. Janderová: Biologie kvasinek (skriptum UK, 2000).
2. Gášková D., Čadek R., Chaloupka R., Plášek J., Sigler K.: Factors underlying membrane potential-dependent and –independent fluorescence responses of potentiometric dyes in stressed cells: diS-C3(3) in yeast, Biochim. Biophys. Acta, 1511 (1) (2001) pp. 74-79
3. Gášková D., Čadek R., Chaloupka R., Vacata V., Gebel J., Sigler K.: Monitoring the kinetics and performance of yeast membrane ABC transporters by diS-C3(3) fluorescence, Int. J. Biochemistry and Cell Biology, 34(8), (2002), 931-937.
4. Maláč J., Urbánková E., Sigler K., Gášková D.: Activity of yeast MDR pumps during growth is controlled by carbon source and the composition of growth-depleted medium: diS-C3(3) fluorescence assay, Int. J. Biochemistry and Cell Biology, 37, (2005), 2536-2543.
5. Maláč J., Sigler K., Gášková D.: Glucose-induced MDR pump resynthesis in respiring yeast cells depends on nutrient level, Biochemical and Biophysical Research Communications 337, (2005), 138-141.
6. Rajendra Prasad and Khyati Kapoor: Multidrug Resistance in Yeast Candida, International Review of Cytology, Vol. 242
7. Elisabetta Balzi and Andre Goffeau: Multiple or pleiotropic drug resistance in yeast, Biochemica et Biophysica Acta, 1073 (1991) 241-252
8. Marcin Kolaczkowski and Andre Goffeau: Active Efflux by Multidrug Transporters as One of the Strategies to Evade Chemotherapy and Novel Practical Implications of Yeast Pleiotropic Drug Resistance, Pharmacol. Ther. Vol. 76, Nos. 1-3, pp. 219-242, 1997
9. Rajendra Prasad, Sneh Lata Panwar and Smriti: Drug Resistance in Yeast - an Emerging Scenario, Advances in Microbial Physiology, Vol. 46
10. Hendrych T., Kodedová M., Sigler K., Gášková D.: Characterization of the kinetics and mechanisms of inhibition of drugs interacting with the S. cerevisiae multidrug resistance pumps Pdr5p and Snq2p, Biochim. Biophys. Acta, 1788, (2009), 717-723

Předběžná náplň práce

Život buněk - základních stavebních jednotek všech organismů - je neodmyslitelně spojen s existencí a funkcí biologických membrán. Tyto vysoce organizované buněčné struktury mají výjimečnou schopnost selektivně transportovat celou řadu relevantních látek.
Membránové proteiny, umožňující transport malých anorganických iontů, vytvářejí díky přenosu náboje přes membránu nejenom chemickou, ale i nábojovou nerovnováhu mezi vnějším a vnitřním prostředím, jejímž důsledkem je rozdíl elektrických potenciálů mezi vnitřní a vnější stranou membrány, tzv. membránový potenciál. Existence membránového potenciálu je esenciální pro život buňky a je jedním ze základních rysů vitálního stavu buňky. U kvasinek (nejpoužívanější modelový organismus eukaryontní buňky) je membránový potenciál dán zejména činností tzv. H+-ATPázy, proteinu, který transportuje protony z buněk na úkor energie uložené v ATP. Na regulaci hodnoty membránového potenciálu se kromě protonů účastní také draselné ionty, které jsou transportovány přes membránu specifickými transportéry (Trk1, Trk2).
V poslední době je mimořádná pozornost věnována membránovým proteinům patřícím do skupiny multidrug resistance transporterů (MDR). Tyto transportéry (pumpy) aktivně odstraňují cizorodé látky z buněk a tím umožňují rezistenci buněk vůči širokému spektru různých strukturně a funkčně odlišných látek (inhibitorů, léků, atd.). Negativně se tak uplatňují např. při odstraňování kvasinkových kontaminací, léčení infekcí apod. Tyto pumpy jsou přítomny v prokaryotech, kvasinkových buňkách i v živočišných buňkách včetně lidských.