|
|
|
||
|
Poslední úprava: Mgr. Lenka Dupejová (06.03.2019)
|
|
||
|
Poslední úprava: doc. RNDr. Petr Sedlak, Ph.D. (27.01.2014)
References J. D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski, M. Zoller - Recombinant DNA. Scientific American Books, New York, 1997. W. B. Coleman, G. J. Tsongalis - Molecular Diagnostics. Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997. R. A. Eeles, B. A. J. Ponder, D. F. Easton, A. Horwich - Genetic Predisposition to Cancer. Chapman and Hall Medical, Oxford, 1996. |
|
||
|
Poslední úprava: doc. RNDr. Petr Sedlak, Ph.D. (27.01.2014)
Podmínky udělení zápočtu: 100% účast na cvičeních,
Podmínky zkoušky: ústní v rozsahu kurzu a doporučené literatury, délka cca 30 minut
|
|
||
|
Poslední úprava: doc. RNDr. Petr Sedlak, Ph.D. (27.01.2014)
1. Základní principy molekulární diagnostiky Principy a reakční komponenty, optimalizační strategie, základní typy izolačních technik pro úspěšnou extrakci nukleové kyseliny, principy purifikace NM a ověření účinnosti izolačních procedur, specifika izolací NK z různých typů tkání, alkalická lýze.
2. Molekulární hybridizace, restrikční mapování Typy hybridních molekul a jejich fyzikálně chemické vlastnosti, Southern-blotting, Northern-blotting a Western-blotting, radioaktivní a neradioaktivní značení sond, metoda mapování pomocí restrikčních fragmentů, restrikční endonukleázy, techniky "dot"-blot a "slot"-blot.
3. Polymerázová řetězová reakce a její modifikace - I Analytická PCR a její specifita či sensitivita, problémy spojené s analýzou PCR-produktů, preparativní PCR, pojem reamplifikace PCR-produktu, příprava PCR-produktu s následnou hybridizací jedno- či dvouřetězcovou sondou.
4. Polymerázová řetězová reakce a její modifikace - II Asymetrická PCR, alelicky specifická amplifikace, nested PCR, multiplex PCR, diferenciální PCR, kompetitivní PCR, látky postihující kvalitu a kavantitu PCR produktu, kontaminace a falešně interpretované výsledky PCR analýzy.
5. Polymerázová řetězová reakce a její moldifikace - III Amplifikace neznámé sekvence, inverzní PCR, Alu-repetitivní PCR, targeted gene walking PCR, "bublinová" PCR, cDNA - PCR 5'- a 3'-konce testovaného fragmentu, expresní PCR, metody neradioaktivních amplifikací - ligázová řetězová reakce, metoda NASBA, metoda detekce "větvené" DNA.
6. Identifikace rozměrových změn v nukleové kyselině Identifikace změn velikosti fragmentu, dělení v agarózovém a polyakrylamidovém gelu, separace radioaktivně a neradioaktivně značených fragmentů, vizualizace fragmentu NK a jeho základní potíže.
7. Identifikace jednonukleotidových změn v nukleové kyselině Metoda detekce jednořetězcových konformačních změn, metoda analýzy heteroduplexů, denaturační gradientová gelová elektroforéza, metoda chemického štěpení nepárujících se nukleotidů, metoda štěpení nepárujících se nukleotidů v duplexu RNA:DNA pomocí ribonukleázy.
8. Sekvenování Sekvenace dle Maxama a Gilberta, sekvenace dle Sangera, základní principy automatického sekvenování, sekvenování biotynylovaných PCR-produktů, výhody a nevýhody jednotlivých sekvenačních přístupů.
9. Nástroje mapování genomu
Buněčné hybridy, izolace chromozómů, krátké sekvence, příprava knihoven, plazmidy, lambda-vektory, kosmidy, umělé chromozómy, náhodně amplifikovaná polymorfní DNA-RAPD technika.
10. Vektory, exprese a transgenese Shuttle vektory, klonování, příprava proteinů. Funkční studie, knockout, inzerční mutageneza. Expresní systémy pro prokaryonta, kvasinky a obratlovce, regulace exprese a studium promotorů a enhancerů - deleční analýza, cílená mutageneza, reportery. Interakce proteinů, yeast two hybrid systémy. Transfekce a transgeneze, problém fenotypu. Genová terapie.
11. Molekulární cytogenetika Hybridizace in situ - princip metody, typy používaných sond, značení sond, hybridizace, detekce a vizualizace značených sond, sumultánní znázornění několika sond in situ hybridizací, komparativní genomová hybridizace -CGH, spektrální karyotypování -SKY.Mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace -mFISH, metoda mnohobarevného pruhování s vysokou rozlišovací schopností -mBAND, 12-barevná mnohočetná FISH- M-TEL, Rx metoda mnohobarevné FISH, metody MikroFISH PRINS, in situ hybridizace s vysokou rezolucí.
12. Čipová analýza Konstrukce a typy laboratoří na dlani, hybridizační mikropřístroje, pasivní "biočipy", membránové šiky (arrays), skleněné "biočipy", aktivní "biočipy", detekce a vyhodnocování výsledků, typy separačních a izolačních mikropřístrojů.
13. Praktické využití metod molekulární diagnostiky - aplikace v lékařských vědách - I Molekulární diagnostika poruch pohybového aparátu, neurodegenerativních onemocnění člověka, nádorových onemocnění, příklady úspěšné diagnostiky potenciálních patogenů člověka atd.
14. Praktické využití metod molekulární diagnostiky - aplikace soudně lékařské - II Typy tkání pro genetické analýzy, způsoby odběru některých tkání, výtěžnost izolačních technik, látky organického i anorganického původu znemožňující úspěšnou amplifikaci DNA, příklady některých řešených případů z občansko-právních sporů a násilné trestné činnosti. |