velikost textu

Charakter bunkovej smrti hostiteľskej bunky indukovanej vírusom vakcínie a inhibičný efekt kyseliny lipoovej na rast vírusu vakcínie

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Charakter bunkovej smrti hostiteľskej bunky indukovanej vírusom vakcínie a inhibičný efekt kyseliny lipoovej na rast vírusu vakcínie
Název v angličtině:
Character of the host cell death induced by vaccinia virus and inhibitory effects of the lipoic acid on vaccinia virus growth
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Martina Spišáková, Ph.D.
Id práce:
99544
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Genetika, molekulární biologie a virologie (NGEMOVI)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
25. 11. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Slovenština
Abstrakt:
Univerzita Karlova v Praze 1. lékařská fakulta Autoreferát dizertační práce Charakter bunkovej smrti hostiteľskej bunky indukovanej vírusom vakcínie a inhibičný efekt kyseliny lipoovej na rast vírusu vakcínie. Mgr. Martina Spišáková Praha 2010 Doktorské studijní programy v biomedicíně Univerzita Karlova v Praze a Akademie věd České republiky Obor: Buněčná a molekulární biologie, genetika a virologie Předseda oborové rady: Prof. RNDr. Stanislav Zadražil, DrSc. Školicí pracoviště: Ústav imunologie a mikrobiologie 1.LF UK Autor: Mgr. Martina Spišáková Školitel: MUDr. Zora Mělková, PhD. Oponenti:…… …… …… Autoreferát byl rozeslán dne .. Obhajoba se koná dne…..….v …………..hod. kde …… S dizertací je možno se před obhajobou seznámit na oddělení pro vědeckou činnost a zahraniční styky děkanátu 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze. 2 Obsah Obsah ..3 Súhrn ..4 Summary ..5 1. Úvod ..5 2. Ciele a hypotézy ..14 3. Materiál a metódy ..14 5. Diskusia ..27 6. Závery ..32 7. Referencie ..33 8. Publikácie ..38 3 Súhrn Vírus vakcínie je typickým zástupcom poxvírusov. V minulosti bol ako vakcína používaný na úspešnú eradikáciu pravých kiahní (ang. smallpox). V súčasnosti je používaný ako vektor pre profylaktické aj experimentálne účely. Táto dizertačná práca nadväzuje na výsledky publikovaných prác z nášho laboratória a je zčasti zameraná na bližšie charakterizovanie vplyvu infekcie vírusom vakcínie na typ bunkovej smrti hostiteľskej bunky. Výsledky ukazujú na to, že počas infekcie vírusom vakcínie sa aktivujú dráhy apoptózy, apoptóza ale nie je dokončená a bunka umiera nekroticky. V našich pokusoch sme farmakologickou inhibíciou aktivity enzýmu PARP (Poly-(ADP-ribóza) polymeráza) nedokázali zmeniť formu bunkovej smrti indukovanú vírusom vakcínie z nekrózy na apoptózu. Efekty anti-apoptotických faktorov kódovaných vírusom vakcínie pravdepodobne hrajú významnejšiu úlohu. Ďalšia časť práce sa venuje sledovaniu inhibičného efektu redox-modulujúcej látky, kyseliny lipoovej, na infekciu vírusom vakcínie. Výsledky ukázali jej inhibičný vplyv v bunkových líniach rôzneho embryonálneho pôvodu. Naše výsledky ukazujú na to, že inhibičný efekt kyseliny lipoovej je na úrovni expresie neskorých génov alebo morfogenézy vírusových častíc. Kyselina lipoová tak ponúka možnosť použitia ako podpornej látky pri liečbe infekcie poxvírusmi. 4 Summary Vaccinia virus is a typical member of the poxvirus family. It had been successfully used during the worldwide smallpox eradication campaign. Currently, it is used as vector for prophylactic, as well as experimental purposes. This PhD thesis stems from the findings previously published in our lab. It is partially focused on a further characterization of vaccinia virus effects on the type of host cell death. The results point to the activation of apoptosis during vaccinia virus infection, but it cannot be completed and the cell dies by necrosis. Our attempts to shift the necrotic type of cell death induced by vaccinia virus infection towards apoptosis using a pharmacological inhibition of activity of a key enzyme PARP (Poly-(ADP-ribose) polymerase) remained unsuccessful. The effects of vaccinia virus-encoded anti- apoptotic factors appear superior to the inhibition of this single enzyme. The second part of the thesis is focused on inhibitory effects of a redox-modulating compound, lipoic acid, on vaccinia virus infection. Our results demonstrated its inhibitory effects in cell lines of different embryonic origin. It appears that the lipoic acid inhibits vaccinia virus growth at the stage of late gene expression or possibly later, during virus morphogenesis. Lipoic acid could be potentially used as a supportive treatment in therapy of a poxvirus infection. 5 1. Úvod 1.1 Vírus vakcínie Vírus vakcínie (VACV) je typickým zástupcom poxvírusov. Genóm VACV pozostáva z jednej molekuly dsDNA o veľkosti približne 195 kb, ktorá kóduje asi 200 proteínov. Replikácia VACV prebieha v cytoplazme hostiteľskej bunky. Vďaka jeho vlastnostiam ako sú vysoká stabilita, jednoduchá a nenákladná príprava, schopnosť indukovať dlhodobú protilátkovú aj bunkovú imunitnú odpoveď a možnosť integrovať veľké časti DNA, je VACV úspešne používaný ako vektor a súčasť niekoľkých rekombinantných vakcín. Rovnako tiež, poskytuje možnosť pre štúdium interakcií s hostiteľskou bunkou (Condit a Niles, 2002; Pastoret a Vanderplasschen, 2003). VACV bol úspešne používaný počas celosvetovej eradikačnej kampane pravých kiahní (smallpox (Buller a Palumbo, 1991). VACV je morfologicky jeden z najväčších vírusov. Tvorí dve infekčné formy, vnútrobunkový zrelý virión (IMV) a extracelulárny obalený virión (EEV; (Schepis et al., 2006). Po vstupe do bunky je z viriónu uvoľňované jadro. Takmer okamžite po vstupe začína transkripcia asi 100 rôznych molekúl skorej mRNA pomocou transkripčného mechanizmu obsiahnutého vo virióne. Skoré mRNA sú potom uvoľňované do cytoplazmy a prebieha syntéza vírusových proteínov (Schramm a Locker, 2005). Replikácia vírusovej DNA je nezávislá na jadre hostiteľskej bunky a prebieha v častiach cytoplazmy nazvaných virozómy alebo vírusové továrne (viral factories). Po replikácii DNA dochádza k syntéze mRNA z intermediárnych génov (Baldick a Moss, 1993). Následne sú exprimované neskoré gény VACV. Niektoré z neskorých 6 proteínov sú glykozylované, fosforylované alebo štiepené pred, alebo počas ich skladania do vírusových častíc (Buller a Palumbo, 1991). Skladanie vírusových častíc je komplexné. Postupne sú štruktúrne proteíny, enzýmy a vírusová DNA obklopované nezrelými membránovými časticami vírusu. Následne sú virióny transportované z cytoplazmy. 1.2 Vplyv infekcie vírusom vakcínie na metabolizmus hostiteľskej bunky VACV, ako typický poxvírus, má cytopatický efekt na hostiteľské bunky, charakteristický podľa typu hostiteľskej bunky. Infekcia VACV má významný vplyv na metabolizmus hostiteľskej bunky. Hostiteľská DNA je hydrolyzovaná endonukleázou prítomnou vo virióne a jej syntéza je zainhibovaná krátko po vstupe vírusu do bunky. Syntéza a procesing hostiteľskej RNA sú tiež zainhibované, ale k tomu dochádza až po syntéze vírusových proteínov. Polčasy hostiteľských aj vírusových RNA sú kratšie počas infekcie VACV. Samotný VACV tiež viacerými mechanizmami inhibuje syntézu hostiteľských proteínov. Miera tejto inhibície závisí na type infikovaných buniek a multiplicite infekcie (Buller a Palumbo, 1991). Naopak, infekcia VACV je tiež ovplyvňovaná metabolizmom hostiteľskej bunky (Vrbacky et al., 2003). 7 1.3 Interakcia vírusu s obranným systémom hostiteľskej bunky Poxvírusy patria vďaka viacerým mechanizmom, ktorými odolávajú a prekonávajú obranu hostiteľskej bunky, medzi úspešné patogény. VACV si vyvinul stratégiu proti komplementovému systému hostiteľskej bunky. VCP (proteín kontrolujúci komplement kódovaný VACV) je 35-kDa proteín produkovaný bunkami infikovanými VACV, ktorý inhibuje aktiváciu klasickej dráhy komplementu (Girgis et al., 2008; Kotwal et al., 1990). Tvorbou homológov receptorov interferónov (IFN) prekonávajú poxvírusy IFN systém hostiteľskej bunky. Tieto receptory sú druhovo špecifické. VACV exprimuje B8R viažuci ľudské a krysie, ale nie myšacie IFNγ, a B18R viažuci IFN α/β viacerých druhov (Alcami a Smith, 1995). Navyše, VACV tiež pôsobí počas efektórovej časti IFN-sprostredkovaných obranných mechanizmov (napr. inhibítory kódované E3L a K3L génmi VACV (Johnston a McFadden, 2003). Proteíny VACV podobne ovplyvňujú aj ďalšie časti IFN dráh. H1L gén VACV exprimuje fosfatázu, ktorá inhibuje IFN- indukovanú aktiváciu transkripčného faktora STAT-1. Produkty VACV génov A46R a A52R obsahujú domény homológne s receptorom Toll-like/IL-1, ktoré umožňujú prerušiť signálnu dráhu IL-1 a inhibovať aktiváciu NF-κB (Johnston a McFadden, 2003). 1.4 Apoptóza Programovaná bunková smrť, apoptóza, hraje dôležitú úlohu v eliminácii infikovaných buniek. Infikované bunky sú kontrolované dvoma mechanizmami vedúcimi k apoptóze. 8 Prvý mechanizmus je prezentácia vírusových proteínov na povrchu infikovaných buniek v komplexe s histokompatibilnými antigénmi. Komplex je potom rozpoznávaný cytotoxickými T-lymfocytmi, ktoré indukujú apoptózu infikovaných buniek. Druhý mechanizmus je spojený s kontrolou vírusovej infekcie samotnou infikovanou bunkou. Bunka rozpozná vírusom indukovanú aktiváciu proteínov bunkového cyklu a spustí proces apoptózy cez proteín p53 (O'Brien, 1998). Zásadným dejom počas apoptózy je štiepenie a aktivácia kaspáz, cysteínových proteáz (Kumar, 2007). Kaspázy sú zapojené do iniciačnej aj efektórovej fázy apoptózy (kaspázy 8, 9, 10 a kaspázy 3, 6, 7). Výsledkom pôsobenia efektórových kaspáz je štiepenie viacerých bunkových proteínov, ktoré vedie k bunkovej smrti. Kaspázy, resp. štiepenie ich substátov, regulujú zásadné morfologické zmeny počas apoptózy (Fischer et al., 2003). Apoptóza môže byť spustená prostredníctvom extracelulárnych alebo intracelulárnych signálov. Dráha spustená extracelulárnymi receptormi je aktivovaná väzbou ligandu na jemu prislúchajúci receptor bunkovej smrti. Po väzbe dochádza k prenosu signálu prostredníctvom adaptérových proteínov a následne je aktivovaná kaspáza 8. Aktívna kaspáza 8 môže aktivovať efektórovú kaspázu 3 a to priamo alebo prostredníctvom proteínu Bid a mitochondrií (Danial a Korsmeyer, 2004). Intracelulárna apoptotická dráha je spúšťaná stresovými signálmi vo vnútri bunky, ktoré vedú k narušeniu funkcie mitochondrií a uvoľňovaniu cytochrómu c a/alebo faktora indukujúceho apoptózu (AIF). Uvoľnenie cytochrómu c vedie prostredníctvom jeho interakcie s adaptérovou molekulou 9 Apaf-1 k aktivácii kaspázy 9 v apoptozóme a následnej aktivácii efektórových kaspáz (Ghobrial et al., 2005). Tretia, nedávno popísaná, dráha spustenia apoptózy vychádza z endoplazmatického retikula (ER). Zmeny v homeostáze iónov Ca2+ a hromadenie nesprávne zložených proteínov vedú k stresu v ER. Ten môže mať za následok aktiváciu kaspázy 12, čo vedie k aktivácii kaspázy 9 (Rao et al., 2004). Počas prebiehajúcej apoptózy predstavujú kľúčový kontrolný bod mitochondrie. Indukcia apoptózy vedie k zníženiu mitochondriálneho membránového potenciálu (∆Ψm) a uvoľňovaniu mnohých pro-apoptotických faktorov (Green a Kroemer, 2004). Uvoľňovanie týchto faktorov z mitochondrií je prísne regulované proteínmi z rodiny Bcl-2. Poxvírusy vyvinuli viaceré mechanizmy ako priamo alebo nepriamo interferovať s procesmi apoptózy. Kódujú prvý popísaný inhibítor kaspáz, CrmA (Taylor a Barry, 2006). Tento proteín, známy tiež ako SPI-2 (serin protease inhibitor 2), inhibuje kaspázy 1 a 8. Jeho homológ, SPI-1, bráni apoptóze väzbou na katepsín G (Guo et al., 2005; Shisler et al., 1999). Medzi niekoľko ďalších proteínov, ktoré sú kódované VACV a inhibujú apoptózu patrí F1L, ktorý je jedinečný pre svoju schopnosť inhibovať znižovanie ΔΨm a uvoľňovanie cytochrómu c z mitochondrií. Možný mechanizmus jeho antiapoptotického pôsobenia je interakcia s BH3-proteínmi rodiny Bcl-2 (Stewart et al., 2005; Wasilenko et al., 2003). 1.5 Redoxný systém kódovaný vírusom vakcínie Niektoré proteíny obsiahnuté vo viriónoch VACV majú vo svojich doménach stabilné disulfidové väzby. Tvorba týchto disulfidových väzieb prebieha v cytoplazme hostiteľskej bunky vírusom-kódovanou dráhou. Dôležitosť tejto dráhy pre 10 úspešnú vírusovú infekciu bola ukázaná znefunkčnením ktoréhokoľvek z troch proteínov dráhy, čo malo za následok zamedzenie tvorby vírusových častíc (Senkevich et al., 2002a; Su et al., 2006). 1.6 Vírus pravých kiahní (Smallpox) – možné zneužitie Prvé pokusy o ochranu pred pravými kiahňami pochádzajú zo starého Egypta. V 18. storočí Edward Jenner zaviedol vakcináciu (Lat. vacca = krava) spočívajúcu v inokulácii materiálu získaného z lézií vzniknutých po infekcii vírusom cowpox ako prevenciu pred pravými kiahňami. VACV sa stal neoddeliteľnou súčasťou vakcín proti pravým kiahňam až na konci 19. storočia. Vakcinácia s rôznymi kmeňmi VACV umožnila eradikáciu pravých kiahní do roku 1980 (WHO, 1980). Odvtedy je očkovanie celkovej populácie pozastavené. Avšak, v posledných rokoch vyvstala hrozba potenciálneho zneužitia vírusu pravých kiahní ako biologickej zbrane. Dopad na dnešnú populáciu by bol, vzhľadom na pozastavené očkovanie, vysokú prenosnosť a úmrtnosť, viac katastrofálny ako v minulom storočí. Na druhej strane, očkovanie VACV je spojené s vyššou pravdepodobnosťou vedľajších účinkov ako ktorákoľvek iná imunizácia a navyše, tieto efekty sú 10-násobne pravdepodobnejšie u prvoočkovaných. Okrem hrozby zneužitia poxvírusov ako biologickej zbrane, vystupuje do popredia hrozba z prirodzeného prostredia, a to od vírusu monkeypox, ktorý spôsobuje u ľudí ochorenie podobné pravým kiahňam. 11 1.7 Post-vakcinačné komplikácie spôsobené vírusom vakcínie Post-vakcinačné komplikácie spôsobené VACV sú hlavne spôsobené nadmerným množením VACV v mieste vakcinácie alebo v ďalších častiach tela. Najčastejšou komplikáciou je náhodná infekcia iných častí kože kvôli rozšíreniu vírusu z miesta očkovania. Generalizovaná vakcínia, stav kedy sa vírus šíri krvou a vyrážky sa objavujú náhodne na navzájom izolovaných častiach tela, je menej častá a zvyčajne bez ďalších komplikácií. Obidva spôsoby šírenia vírusu môžu mať závažné následky pre ľudí s poruchami imunity. K vážnym komplikáciám po očkovaní dochádza hlavne u osôb s poruchami prirodzenej alebo špecifickej imunity. Môže dôjsť k eczema vaccinatum, progresívnej vakcínii alebo post- vakcinačnej encefalitíde. Medzi ďalšie komplikácie patria fetálna vakcínia, kožný erytém, myoperikarditída a bakteriálne superinfekcie (Bray, 2003; Fulginiti, 2003). 1.8 Terapia postvakcinačných komplikácií spôsobených vírusom vakcínie Do 50. rokov 20. storočia, kedy boli zavedené VACV imunoglobulín (VIG) a tiosemikarbazónové deriváty, nebola dostupná žiadna špecifická terapia na postvakcinačné komplikácie spojené s očkovaním VACV. Počas dlhoročného výskumu bol VACV zaradený do kategórie vírusov, ktoré sú testované na citlivosť na rôzne skupiny látok. Väčšina látok, u ktorých bola dokázaná účinnosť proti VACV sú nukleozidové analógy. Do skupiny nukleozidových analógov patrí tiež jediná látka schválená FDA USA na liečbu postvakcinačných reakcií po VACV vakcíne, cidofovir 12 (Vistide®, HPMPC), ktorý bol objavený prof. Holým (De Clercq et al., 1986). Nevýhodou tohto preparátu je jeho intravenózna aplikácia a nefrotoxicita (Safrin et al., 1997). Jedinečná antivírusová aktivita cidofoviru však viedla k vývoju jeho formy pre orálne podanie, CMX001 (Sliva a Schnierle, 2007) a ďalších derivátov (Krecmerova et al., 2007). V posledných troch rokoch bola objavená skupina anti- poxvírusových látok, ktoré redukujú šírenie vírusovej infekcie: Gleevec (STI-571, Glivec) a ST-246 (Sliva a Schnierle, 2007). 1.9 Látky reagujúce s tiolovými skupinami Časť tejto práce je zameraná na inhibičné efekty látok reagujúcich s tiolovými skupinami na rast a replikáciu VACV, zvlášť kyseliny lipoovej (LA). Kyselina lipoová (LA) je disulfidový derivát kyseliny oktánovej (kaprylovej), ktorý v oxidovanej forme tvorí intramolekulovú disulfidovú väzbu. Pravdepodobným miestom jej syntézy a funkcie sú mitochondrie (Bilska a Wlodek, 2005). Zvýšený záujem o túto látku v súčasnej medicíne vyplýva z jej unikátnej redukčnej schopnosti. Redukovaná LA sa podieľa jednak na reakciách neutralizujúcich kyslíkové radikály, ako aj na reakciách redukujúcich oxidované formy iných antioxidantov. Navyše má LA ďalšiu špecifickú vlastnosť, a to je rozpustnosť nielen vo vode, ale aj v tukoch. Všetky tieto zmienené vlastnosti prispievajú k tomu, že sa LA tiež nazýva „antioxidant medzi antioxidantmi“ (Bilska a Wlodek, 2005). V súčasnosti vzbudzuje LA značný záujem pre jej terapeutické použitie a pozitívny vplyv na liečbu viacerých ochorení ako sú diabetes, arteroskleróza, degeneratívne nervové ochorenia alebo AIDS (Bilska a Wlodek, 2005). 13 Bolo ukázané, že LA inhibuje replikáciu HIV zainhibovaním aktivácie NFκB v bunkových kultúrach (Pande a Ramos, 2003). 2. Ciele a hypotézy V tejto práci sme sa zamerali hlbšie objasnenie skôr opublikovaných výsledkov týkajúcich sa aktivácie kaspáz počas infekcie VACV a na efekty redox-modulujúcich látok na infekciu VACV. Konkrétne ciele práce: 1. Sledovanie štiepenia substrátov proteáz počas infekcie VACV. 2. Vplyv inhibície aktivity kaspáz a PARP na infekciu VACV. 3. Príprava bunkových línií indukovateľne exprimujúcich Bcl- 2 a sledovanie efektu expresie Bcl-2. 4. Charakterizácia efektu redox-modulujúcich látok, zvlášť kyseliny lipoovej, na infekciu VACV. 3. Materiál a metódy Chemikálie. Všetky použité kultivačné média a rastové doplnky boli od firiem Invitrogen, Gibco alebo PAA Laboratories. Ďalšie chemikálie boli od firiem Sigma, Fluka, Promega, R&D Systems, Applied Biosystems a Molecular Probes. Bunkové línie. Nasledujúce bunkové línie boli použité v experimentoch: ľudská epitelová línia HeLa-G, obličková línia mačiaka zeleného BSC-40, myšacia fibroblastová línia L929, myšacia monocytovo/makrofágová línia J774.G8 a ľudská línia Jurkat. 14 Príprava a skríning stabilne transfekovaných bunkových línií. Stabilne transfekované bunkové línie boli pripravené podľa protokolu výrobcu transfekčného systému Tet-On. Ako transfekčné činidlo bol použitý Superfect (Qiagen). Stabilne transfekované bunkové línie boli selektované v prítomnosti G.418 a hygromycínu. Transfekované bunky boli skrínované pomocou stanovenia luciferázovej aktivity po transientnej transfekcii reportérového plazmidu alebo pomocou western blotu. Vírusy. Wild-type VACV (WT-VACV), kmeň Western Reserve (WR; ATCC VR-119) a rekombinantný VACV exprimujúci chloramfenikol acetyltransferázu (CAT), Bcl-2, PKR, inducibilnú NO-syntetázu (iNOS) a luciferázu (Luc) boli použité v experimentoch. Prietoková cytometria. Na analýzy prietokovou cytometriou bol použitý prietokový cytometer FACScan (Beckton Dickinson). Analýza nameraných údajov bola urobená s pomocou softwéru WinMDI v2.8. Fluorescenčná mikroskopia. Kultivované bunky boli sledované priamo na kultivačných platniach za pomoci inverzného fluorescenčného mikroskopu Olympus IX-70. Western blot. SDS-PAGE a Western blotting boli robené podľa publikovaných protokolov (Ausubel et al., 2002; Harlow a Lane, 1988; Laemmli, 1970). Izolácia DNA a real-time PCR. Na real-time PCR analýzu boli bunky pripravené podľa publikovaného protokolu (Schmidtmayerova et al., 1998). Vírusová DNA bola kvantifikovaná pomocou Applied Biosystems 7300 Real-time PCR systému. Primery a sondy boli pripravené Applied Biosystems ako Custom TaqMan® Gene Expression Assay. Set primerov a sonda boli navrhnuté proti koncovej časti 15 genómu VACV. Výsledky boli analyzované Sequence Detection Softwérom (Applied Biosystems). Štatistika. Výsledky sú prezentované ako priemery +/- S.E.M. (standard error of mean). Štatistické rozdiely v rámci jednotlivých skupín boli vypočítaváne pomocou ANOVA. Štatistické rozdiely medzi jednotlivými skupinami a kontrolami alebo medzi dvoma odlišnými skupinami boli hodnotené pomocou Student t-testu. 4. Výsledky 4.1. Lýtický charakter bunkovej smrti v bunkách infikovaných vírusom vakcínie VACV spôsobuje vo väčšine infikovaných buniek lýzu, ekvivalent nekrózy. Bcl-2 exprimovaný VACV má dva protichodné účinky, ktoré už boli v minulosti viackrát popísané: má typický anti-apoptotický efekt v bunkách HeLa G, zatiaľ čo indukuje apoptózu v bunkách BSC-40 (Kalbacova et al., 2008; Kalbacova et al., 2003; Melkova et al., 1997; Vrbacky et al., 2003). Tieto výsledky boli rovnako potvrdené aj v tejto práci (Kalbacova et. al. 2008). 4.2. Aktivita kaspáz počas lýtickej infekcie vírusom vakcínie V bunkách HeLa G a BSC-40 infikovaných VACV bola prietokovou cytometriou pozoravaná aktivácia a/aktivita kaspáz (Kalbacova et al., 2008; Kalbacova et al., 2003). Vzhľadom na to, že tieto skôr namerané výsledky pochádzali len z infekčných experimentov, rozhodli sme sa ich doplniť a porovnať o hodnoty získané po indukcii apoptózy 16 používanými neinfekčným induktormi, staurosporínom a ionomycínom, v rovnakých experimentálnych podmienkach. Na základe našich výsledkov môžeme zhrnúť, že indukcia apoptózy ionomycínom a staurosporínom viedla k významne zvýšenej aktivácii/aktivite kaspáz. Miera aktivácie a aktivity kaspáz v tomto neinfekčnom usporiadaní je porovnateľná s mierou v bunkách infikovaných VACV (Kalbacova et al., 2008). 4.3. Štiepenie substrátov kaspáz počas infekcie vírusom vakcínie Pre doplnenie meraní prietokovou cytometriou, rozhodli sme sa charakterizovať aktivitu kaspáz analýzou štiepenia substrátov kaspáz pomocou western blotu. 4.3.1. Cytokeratín 18 Najskôr sme analyzovali štiepenie cytokeratínu 18. Zjavný pokles hladín neštiepeného cytokeratínu 18 bol pozorovaný v bunkách HeLa G a BSC-40 infikovaných VACV (Obr. 1). Môžeme uzavrieť, že infekcia oboma použitými rekombinantmi VACV viedla k poklesu hladín cytokeratínu 18 v obidvoch testovaných bunkových líniách. Obr. 1. Analýza štiepenia cytokeratínu 18 vo VACV infikovaných bunkách pomocou western blotu. 17 4.3.2. Aktín Aktín, jedna zo súčastí cytoskeletu bunky, je tiež substrátom kaspáz. Jeho štiepená forma prispieva k apoptotických zmenám morfológie buniek (Chang a Yang, 2000; Stroh a Schulze-Osthoff, 1998). Infekcia s obidvoma použitými rekombinantmi VACV viedla k poklesu hladín aktínu v bunkách HeLa G v 24 h.p.i. (hodinách od infekcie). Infekcia VACV neviedla k žiadnym zmenám v hladinách aktínu v bunkách BSC-40 (Obr. 2). Obr. 2. Analýza štiepenia aktínu vo VACV infikovaných bunkách pomocou western blotu. 4.3.3. PARP Ďalej sme tiež analyzovali štiepenie proteínu PARP (poly-(ADP-ribózo) polymeráza), typického substrátu kaspáz. PARP je počas apoptózy inaktivovaný štiepením na 85 kDa fragment (Kaufmann et al., 1993). Žiadne významné štiepenie PARP vo VACV- infikovaných bunkách HeLa G v porovnaní s neinfikovanými kontrolami sme nezaznamenali (Obr. 3). Podobne, PARP nebol štiepený ani v neinfikovaných a VACV-CAT infikovaných bunkách BSC-40. Naopak, 85 kDa fragment PARP bol pozorovaný v bunkách BSC-40 infikovaných VACV-Bcl-2. 18 Tento výsledok korešponduje s apoptotickou morfológiou týchto buniek od 12 h.p.i. Získané výsledky ukazujú, že štiepenie PARP typické pre apoptotické bunky bolo pozorované len u tých buniek infikovaných VACV, ktoré vykazujú morfologické známky apoptózy. Obr. 3. Analýza štiepenia PARP vo VACV infikovaných bunkách pomocou western blotu. 4.4. Vplyv inhibície kaspáz na infekciu vírusom vakcínie Na základe predchádzajúcich výsledkov sa zdá, že kaspázy zohrávajú určitú úlohu počas rastového cyklu VACV. Rozhodli sme sa teda sledovať efekt pôsobenia inhibície kaspáz na infekciu VACV. Obr. 4 ukazuje, že pridanie širokospektrálneho kaspázového inhibítora z-VAD-FMK nemá žiadny štatisticky významný vplyv na infekciu VACV v bunkách HeLa G ani BSC-40. 19 Obr. 4. Vplyv širokospektrálneho kaspázového inhibítora z-VAD-FMK na rast VACV. Ďalšie analýzy štiepenia cytokeratínu 18 v prítomnosti z- VAD-FMK ukázali, že cytokeratín 18 je pravdepodobne štiepený inými proteázami ako kaspázy. 4.5. Vplyv inhibície aktivity PARP na infekciu vírusom vakcínie Na základe predchádzajúcich výsledkov môžeme uvažovať o možnosti, že počas infekcie VACV dochádza k zmene v prebiehajúcej bunkovej smrti. Začínajúca apoptóza, o ktorej svedčí aktivácia kaspáz, sa, zdá sa, mení a pokračuje ako nekróza. Je možné, že k zmene dochádza v dôsledku zníženia dostupných energetických zdrojov. Štiepenie PARP je kritickým momentom, ktorý rozhoduje či bunkové signály smerujú bunku k apoptóze alebo nekróze (Nicotera a Leist, 1997). Aktivácia PARP vedie k zníženiu dostupných zdrojov ATP, čo má za následok nekrózu. Naopak, pokiaľ je PARP štiepený, zdroje ATP zostávajú zachované a bunka má dosť energie na procesy apoptózy. Vzhľadom na to, že PARP nie je štiepený počas infekcie VACV, je pravdepodobne aktívny. Jeho farmakologické zainhibovanie by mohlo mať teda za následok uchovanie ATP, a tým aj možnosť bunkovej smrti 20 apoptózou. Na zablokovanie aktivity PARP sme zvolili jeho účinný inhibítor PJ 34. V bunkách s pridaným inhibítorom sme nepozorovali žiadne zmeny v štiepení PARP. Naopak, pozorovali sme štiepenie cytokeratínu 18 v bunkách HeLa G infikovaných VACV s pridaným PJ 34. Keďže infekcia VACV indukuje znižovanie ΔΨm a/alebo znižovanie celkových hladín ATP, analyzovali sme tiež zmeny funkcie mitochondrií v prítomnosti PJ 34. Avšak, pridanie inhibítora aktivácie PARP počas infekcie VACV nemalo významný vplyv na zmeny ΔΨm indukované VACV. Súhrnne, neukázali sme žiadny významný vplyv inhibície aktivácie PARP na infekciu VACV a typ bunkovej smrti. Antiapoptotické mechanizmy kódované VACV pravdepodobne ovplyvňujú bunkovú smrť hostiteľskej bunky viac a ich úloha je významnejšia ako vplyv PJ 34. 4.6. Stabilne transfekované bunkové línie Unikátna pro-apoptotická aktivita protoonkogénu Bcl-2 exprimovaného VACV (Kalbacova et al., 2008; Kalbacova et al., 2002) môže byť daná proteínom samotným a jeho chovaním v špecifickom bunkovom prostredí, rovnako ako aj expresným systémom. Pokúsili sme sa preto objasniť chovanie Bcl-2 za využitia expresie tohto proteínu iným expresným systémom ako VACV. Zvolili sme expresný systém Tet-On, ktorý by mal mať vysokú mieru expresie v porovnaní s bazálnou expresiou a koncentračne závislú reguláciu expresie. 21 4.6.1. Vplyv inducibilnej expresie Bcl-2 na bunky BSC-40 infikované vírusom vakcínie Pripravili sme stabilne transfekovanú bunkovú líniu BSC-40 exprimujúcu Bcl-2 pod inducibilným promotorom Tet-On. Indukcia Bcl-2 však neviedla k žiadnym významným morfologickým zmenám v stabilne transfekovanej bunkovej línii BSC-40 a bunky vykazovali typickú morfológiu buniek BSC-40. Analyzovali sme tiež vplyv expresie Bcl-2 na infekciu VACV. Analýza integrity plazmatickej membrány prietokovou cytometriou ukázala zmeny typické pre lýtickú infekciu VACV. Avšak, žiadne významné zmeny spôsobené inducibilnou expresiou Bcl-2 systémom Tet-On sme nepozorovali. Podobne sme nezaznamenali žiadne zmeny v ΔΨm po inducibilnej expresii Bcl-2. Na základe našich výsledkov môžeme uzavrieť, že v našom experimentálnom usporiadaní a s mierou expresie dosiahnutou expresným systémom Tet-On, nemala expresia Bcl-2 žiadny významný efekt na morfológiu stabilne transfekovanej bunkovej línie BSC-40 ani na infekciu VACV. 4.7. Vplyv redox-modulujúcich látok na infekciu vírusom vakcínie Štruktúra VACV je závislá na disulfidických väzbách vznikajúcich počas morfogenézy viriónu za prispenia viacerých VACV redoxných proteínov (Locker a Griffiths, 1999; Senkevich et al., 2002a; Senkevich et al., 2002b). Je teda možné, že látky ovplyvňujúce redox prostredie infikovanej bunky by mohli ovplyvniť aj infekciu VACV. 22 4.7.1. Vplyv rôznych redox-modulujúcich látok na infekciu vírusom vakcínie V našich experimentoch sme analyzovali efekt piatich rôznych redox-modulujúcich látok (β-merkaptoetanol, DTT, kyselina askorbová, LA a kyselina etakrynová) na infekciu VACV (Spisakova et al., 2009). Vplyv na rast VACV sme najskôr charakterizovali luciferázovou aktivitou v bunkách infikovaných rekombinantom VACV exprimujúcim luciferázu (Obr. 5). U troch testovaných látok - β-merkaptoetanolu, DTT a kyseliny askorbovej, sme namerali štatisticky významné zvýšenie luciferázovej aktivity. Ďalšie dve analyzované látky, LA a kyselina etakrynová, mali naopak za následok štatisticky významné zníženie luciferázovej aktivity. Obr. 5. Vplyv rôznych redox-modulujúcich látok na infekciu VACV. Na základe zistených výsledkov sme sa rozhodli bližšie charakterizovať inhibičný efekt LA na infekciu VACV. V sérii experimentov s LA sme potvrdili jej inhibičný efekt na rast VACV v bunkových líniách rôzneho pôvodu. 23 4.7.2. Vplyv kyseliny lipoovej na expresiu skorých a neskorých génov vírusu vakcínie Najskôr sme charakterizovali v ktorej fáze rastového cyklu VACV k inhibícii LA dochádza. Na rozlíšenie vplyvu na syntézu skorých alebo neskorých génov VACV, boli použité rekombinanty VACV exprimujúce luciferázu pod dvoma rôznymi promotormi VACV (skorý/neskorý – VACV E/L a neskorý – VACV L). K vzorkám bol pridaný inhibítor DNA polymerázy, cytozín arabinozid (Ara C). Keďže Ara C inhibuje DNA syntézu VACV, nedochádza po jeho pridaní k expresii neskorých génov VACV. Preto sme mohli v prítomnosti Ara C odlíšiť aktivitu luciferázy exprimovanej len pod skorým VACV promotorom. Výsledky ukázali, že LA nemá inhibičný efekt na expresiu skorých génov VACV po zablokovaní expresie neskorých génov (Obr. 6). Obr. 6. Vplyv LA na expresiu skorých a neskorých génov VACV. 24 4.7.3. Vplyv kyseliny lipoovej na celkovú expresiu proteínov vírusu vakcínie V ďalšom experimente sme western blotom analyzovali vplyv LA na celkovú expresiu VACV proteínov v bunkách HeLa G. Pridanie 250 a 500 µM LA nemalo viditeľný efekt na hladiny VACV proteínov v obidvoch použitých rekombinantoch. Po pôsobení 1 mM LA sme zaznamenali len mierne zníženie hladín proteínov. Na základe uvedených výsledkov sa dá predpokladať, že inhibičný efekt LA na infekciu VACV je na úrovni syntézy vírusovej DNA, syntézy neskorých proteínov alebo počas morfogenézy viriónov. 4.7.4. Vplyv kyseliny lipoovej na replikáciu DNA vírusu vakcínie Vplyv LA na replikáciu VACV DNA sme analyzovali pomocou real-time PCR. Výsledky na Obr. 7 ukazujú, že LA nemá inhibičný vplyv na syntézu vírusovej DNA. Na základe toho sa dá predpokladať, že LA má efekt na procesy prebiehajúce ešte neskoršie počas rastového cyklu VACV, na úrovni expresie neskorých génov VACV alebo morfogenézy. Obr. 7. Vplyv LA na DNA syntézu VACV. 25 4.7.5. Vplyv kyseliny lipoovej na infekciu vírusom vakcínie v závislosti od času pridania Aby sme mohli potvrdiť efekt LA na jednotlivé časti rastového cyklu VACV, rozhodli sme sa ešte zanalyzovať závislosť vplyvu LA na čase pridania k infikovaným bunkám. Obr. 8 ukazuje štatisticky významný inhibičný vplyv LA, pokiaľ bola pridaná do 4 h.p.i., čo je približne čas začiatku syntézy vírusovej DNA. Menšiu, aj keď štatisticky významnú, inhibíciu môžeme ale vidieť aj po pridaní LA v čase 8 h.p.i. Keďže už replikácia DNA dovtedy prebehla, výsledky podporujú predchádzajúce závery, že LA inhibuje rast VACV na úrovni expresie neskorých proteínov VACV. Obr. 8. Vplyv LA na infekciu VACV v závislosti od času pridania. Celkovo môžeme uzavrieť, že sme ukázali inhibičný efekt LA na infekciu VACV, a to v bunkových líniách rôzneho pôvodu. Podľa našich výsledkov dochádza k inhibícii v neskorších fázach rastového cyklu VACV, na úrovni expresie neskorých VACV proteínov alebo možno na úrovni morfogenézy viriónov. 26 5. Diskusia 5.1. Typ bunkovej smrti indukovaný infekciou vírusom vakcínie VACV spôsobuje u väčšiny infikovaných buniek lýzu, ktorá je považovaná za ekvivalent nekrózy. Morfológia buniek v nami používaných epiteliálnych bunkových líniách po infekcii VACV potvrdzuje nekrotický charakter bunkovej smrti. Výnimkou je apoptóza indukovaná po infekcii VACV- Bcl-2 v bunkách BSC-40. V tomto prípade ide ale o fenomén proapoptotického pôsobenia Bcl-2 exprimovaného VACV. Nekróza a apoptóza sa líšia viacerými morfologickým a biochemickými procesmi. Najviac charakteristicky počas apoptózy, na rozdiel od nekrózy, dochádza k aktivácii kaspáz. Moja kolegyňa, Marie Kalbáčová, zaznamenala aktiváciu kaspáz počas lýtickej infekcie VACV (Kalbacova et al., 2008). Vzhľadom na pozorované neočakávané aktivovanie kaspáz počas lýtickej infekcie, rozhodli sme sa ďalej analyzovať typ bunkovej smrti spôsobenej infekciou VACV. Štiepenie špecifických substrátov kaspáz v bunkách infikovaných VACV bolo sledované pomocou western blotu. Naše výsledky potvrdili štiepenie cytokeratínu 18 počas lýtickej infekcie VACV v oboch testovaných bunkových líniách, zatiaľ čo opačné výsledky boli pozorované u PARP. Nezaznamenali sme žiadne štiepenie PARP v žiadnej bunkovej línii infikovanej VACV. Preto môžeme predpokladať, že PARP je aktívny v týchto bunkách a prispieva k spotrebuvávaniu bunkového ATP, čo vedie k nekróze infikovaných buniek. Avšak, dôvody prečo cytokeratín 18 je štiepený a PARP nie je počas infekcie VACV, ostávajú stále nevysvetlené. 27 Zdá sa teda, že apoptóza je aktivovaná počas infekcie VACV, ale nemôže byť dokončená a bunka umiera nekroticky. Možné vysvetlenie je iniciácia apoptotického programu infekciou VACV, ale neskôr je apoptóza inhibovaná rôznymi inhibítormi kaspáz a ďalšími proteínmi ovplyvňujúcimi apoptózu, ktoré sú kódované a exprimované VACV (Stewart et al., 2005; Taylor et al., 2006; Wasilenko et al., 2003). Infekcia VACV spôsobuje apoptózu v niektorých imunitných bunkách (makrofágy, dendritické bunky a B lymfocyty) (Baixeras et al., 1998; Engelmayer et al., 1999; Humlova et al., 2002). V týchto prípadoch ide pravdepodobne o stratégiu prekonávania imunitného obranného systému hostiteľa, ale poukazujú tiež na fakt, že v niektorých bunkách je pravdepodobne dostatok energetických zdrojov pre apoptotickú formu bunkovej smrti. 5.1.1. Vplyv inhibície kaspáz na infekciu vírusom vakcínie Podľa našich výsledkov sa zdá, že aktivácia kaspáz zohráva nejakú úlohu pri infekcii VACV, rozhodli sme sa teda sledovať vplyv prípadnej inhibície kaspáz na priebeh infekcie VACV. Avšak, získané výsledky potvrdili len okrajový efekt širokospektrálneho kaspázového inhibítora na rast VACV. V našich experimentoch sme ale zistili ešte výraznejšie zníženie hladín celkového cytokeratínu 18 po zainhibovaní kaspáz. Zdá sa teda, že cytokeratín 18 je v bunkách infikovaných VACV štiepený aj inými proteázami ako len kaspázami. 28 5.1.2. Vplyv inhibície PARP na bunkovú smrť indukovanú vírusom vakcínie Dostupnosť intracelulárneho ATP je rozhodujúcim činiteľom o forme bunkovej smrti. Bolo ukázané, že pokiaľ bola hladina ATP redukovaná, výsledkom pôsobenia, inak typicky apoptotického stimulu, bola nekróza (Leist et al., 1997). Dôležitú úlohu v regulácii obsahu intracelulárneho ATP hraje PARP, ktorý je pravdepodobne aktivovaný poškodením DNA indukovaným VACV. Našim cieľom bolo pomocou inhibítora PARP, PJ 34, zabrániť enzýmovej aktivite PARP a tým ušetriť energetické zdroje v bunke pre procesy apoptózy. Analýzou western blotom sme ale neukázali žiadne zmeny v hladinách PARP, alebo v jeho štiepení, v bunkách infikovaných VACV s pridaným inhibítorom PARP. Rovnako tiež neboli pozorované žiadne známky apoptózy. V realizovaných experimentoch je pravdepodobné, že aktivita PARP bola zainhibovaná, ale farmakologická inhibícia tohto jedného proteínu nestačila na zmenu formy bunkovej smrti. Prispenie rôznych inhibítorov apoptózy kódovaných VACV je pravdepodobne významnejšie ako vplyv inhibítora PARP. 5.2. Stabilne transfekované bunkové línie Dôležitú úlohu pri prejave konkrétneho rekombinantného proteínu hraje aj interakcia VACV s hostiteľskou bunkou. Prejav proteínu Bcl-2 po expresii VACV sa líši podľa typu bunkovej línie a metabolizmu. Preto sme sa pre odlíšenie efektov interakcie Bcl-2 a VACV od efektu odlišného bunkového prostredia rozhodli použiť iný expresný systém ako vírusový. 29 Po úspešnej príprave bunkovej línie BSC-40 inducibilne exprimujúcej Bcl-2 pod kontrolou promotora indukovateľného doxycyklínom sme chceli charakterizovať jeho efekt na procesy apoptózy. Naše pokusy nepotvrdili žiadny vplyv exprimovaného Bcl-2 na morfológiu buniek, zmeny metabolizmu ani infekciu VACV stabilne transfekovaných buniek. Avšak, bližšiu charakterizáciu vplyvu overexpresie Bcl-2 sme nemohli urobiť kvôli nízkym a vytrácajúcim sa hladinám exprimovaného Bcl-2. Vyššia expresia Bcl-2 bunkám BSC-40 pravdepodobne škodí, podobne ako to bolo s pozorovanou apoptózou v bunkách BSC-40 infikovaných VACV-Bcl-2. Dôvod, prečo sme nepozorovali žiadny efekt Bcl-2 exprimovaného stabilne transfekovanou bunkovou líniou, môže byť nízka miera expresie v porovnaní s expresným systémom VACV. Preto by bolo vhodnejšie, na sledovanie efektov Bcl-2 nezávislých na VACV, použiť silnejší expresný systém, napr. adenovírusový. 5.3. Vplyv redox-modulujúcich látok na rast vírusu vakcínie V poslednej časti práce sme sa zamerali na bližšie charakterizovanie efektov redox-modulujúcich látor, zvlášť LA, na infekciu VACV. Najskôr sme experimentálne stanovovali efekt piatich rôznych redox-modulujúcich látok, β- merkaptoetanolu, DTT, kyseliny askorbovej, LA a kyseliny etakrynovej na infekciu VACV. Inhibičný efekt na infekciu VACV sme zaznamenali len po pôsobení LA a EA. Účinok bol koncentračne závislý, účinné koncentrácie sa u LA pohybovali v stovkách mikromolov. Mechanizmom inhibičného efektu sprostredkovaného LA je možno vplyv na tvorbu disulfidových väzieb a/alebo reakcia so zložkami 30 ovplyvňujúcimi redox prostredie v bunke. LA má jednak vplyv na redox závislé proteíny VACV a jednak na redox prostredie v bunke a to reakciou s antioxidantmi. Morfogenéza VACV je závislá na redoxnej dráhe kódovanej VACV, ktorá pozostáva z postupnej tvorby disulfidických väzieb. Vyradenie ktoréhokoľvek z troch kľúčových proteínov VACV z funkcie má za následok pozastavenie správnej maturácie vírusových častíc (Su et al., 2006). K inhibícii indukovanej LA môže tiež dochádzať inhibíciou aktivácie NF-κB znižovaním hladín voľných kyslíkových radikálov. Musíme ale podotknúť, že už VACV samotný inhibuje aktiváciu NF-κB a jeho presun do jadra (Graham et al., 2008). V našich experimentoch sme potvrdili inhibičný efekt LA v bunkových líniách rôzneho pôvodu. Tiež sme MTT ukázali, že účinné koncentrácie LA nemajú toxický účinok v testovaných bunkových líniách. IC50 LA stanovené pre titer VACV boli v rozmedzí 200-500 μM. Publikované hodnoty IC50 cidofoviru pre VACV sú 9,8 μM pre ľudské embryonálne fibroblasty a 54 - 62 μM pre Vero bunky. Aj keď sa hodnoty získané inými testami a za iných podmienok dajú porovnávať len s určitou rezervou, nami stanovené hodnoty LA sú v tomto porovnaní pravdepodobne terapeuticky nezaujímavé. Cieľom práce však bolo opísať nový inhibičný efekt LA na rast VACV a bližšie charakterizovať fázu rastového cyklu VACV, ktorá je inhibovaná. Získané výsledky - LA indukovaná inhibícia expresie neskorých génov VACV alebo vírusovej morfogenézy, ukazujú na novú možnosť inhibície poxvírusovej infekcie. Hoci sú koncentrácie LA účinné proti VACV vysoké, má LA viaceré pozitívne vlastnosti, ktoré ju robia zaujímavým cieľom pre budúce skúmania a vývoj. LA je dobre absorbovaná 31 z čreva a dobre prechádza aj hematoencefalickou bariérou, je netoxická aj vo vysokých koncentráciach a je používaná ako potravinový doplnok. Hoci sa o LA nedá uvažovať ako o samostatnej liečbe proti poxvírusovej infekcii, určite však poskytuje možnosť použitia ako podpornej terapie v kombinácii s inou účinnou látkou. 6. Závery Práca bola zameraná na podrobnejšiu analýzu skôr sledovaných dejov prebiehajúcich počas infekcie VACV a na nové inhibičné vlastnosti niektorých redox-modulujúcich látok. Výsledky sa dajú stručne zhrnúť následovne: 1. V experimentoch sledujúcich štiepenie substrátov kaspáz, sme potvrdili štiepenie cytokeratínu 18. Na druhej strane však štiepenie typického substrátu kaspáz, PARP, nebolo pozorované. Výsledky ukazujú na možnosť aktivácie dráh apoptózy počas infekcie VACV, tá ale následne nemôže byť dokončená a bunka umiera nekroticky. 2. Experimenty sledujúce vplyv inhibície kaspáz počas infekcie VACV boli získané po pridaní širokospektrálneho inhibítora kaspáz z-VAD-FMK. Tento inhibítor však vykazoval len okrajový efekt na rast VACV a naopak, indukoval zvýšené štepenie cytokeratínu 18, čo ukazuje na fakt, že na štiepení cytokeratínu 18 zrejme participujú iné proteázy ako kaspázy. Pokusy zamerané na inhibíciu aktivity PARP s cieľom zmeniť formu bunkovej smrti z nekrotickej na apoptózu počas infekcie VACV boli neúspešné. Efekty anti-apoptotických 32 faktorov kódovaných VACV hrajú významnejšiu úlohu ako inhibícia aktivity PARP. 3. Pripravili sme stabilne transfekovanú bunkovú líniu BSC-40 exprimujúcu Bcl-2 pod kontrolou inducibilného expresného systému Tet-On. V pokusoch sme po expresii Bcl- 2 neukázali žiadne významné zmeny v type bunkovej smrti. Avšak, bližšie sledovanie vplyvu overexpresie Bcl-2 nebolo dokončené kvôli nízkym a vytrácajúcim sa hladinám exprimovaného Bcl-2. Vyššia expresia Bcl-2 pravdepodobne škodí bunkám BSC-40. 4. V experimentoch zameraných na vplyv piatich redox- modulujúcich látok na rast VACV sme pozorovali jednak stimulačný efekt u β-merkaptoetanolu, DTT a kyseliny askorbovej, jednak koncentračne závislý inhibičný efekt u kyseliny lipoovej a etakrynovej. Podľa experimentov podrobnejšie charakterizujúcich mechanizmus inhibície LA sa zdá, že k nej dochádza na úrovni expresie neskorých génov VACV alebo morfogenézy vírusových častíc. 7. Referencie 1. Alcami, A. a Smith, G.L. (1995) Cytokine receptors encoded by poxviruses: a lesson in cytokine biology. Immunol Today 16(10), 474-8. 2. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. a Struhl, K. (2002) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons. 3. Baixeras, E., Cebrian, A., Albar, J.P., Salas, J., Martinez, A.C., Vinuela, E. a Revilla, Y. (1998) Vaccinia virus-induced apoptosis in immature B lymphocytes: role of cellular Bcl-2. Virus. Res. 58(1-2), 107-13. 33 4. Baldick, C.J., Jr. a Moss, B. (1993) Characterization and temporal regulation of mRNAs encoded by vaccinia virus intermediate-stage genes. J Virol 67(6), 3515-27. 5. Bilska, A. a Wlodek, L. (2005) Lipoic acid - the drug of the future? Pharmacol Rep 57(5), 570-7. 6. Bray, M. (2003) Pathogenesis and potential antiviral therapy of complications of smallpox vaccination. Antiviral Res 58(2), 101-14. 7. Buller, R.M. a Palumbo, G.J. (1991) Poxvirus pathogenesis. Microbiol Rev 55(1), 80-122. 8. Condit, R.C. a Niles, E.G. (2002) Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochim Biophys Acta 1577(2), 325-36. 9. Danial, N.N. a Korsmeyer, S.J. (2004) Cell death: critical control points. Cell 116(2), 205-19. 10. De Clercq, E., Holy, A., Rosenberg, I., Sakuma, T., Balzarini, J. a Maudgal, P.C. (1986) A novel selective broad-spectrum anti-DNA virus agent. Nature 323(6087), 464-7. 11. Engelmayer, J., Larsson, M., Subklewe, M., Chahroudi, A., Cox, W.I., Steinman, R.M. a Bhardwaj, N. (1999) Vaccinia virus inhibits the maturation of human dendritic cells: a novel mechanism of immune evasion. J. Immunol. 163(12), 6762-8. 12. Fischer, U., Janicke, R.U. a Schulze-Osthoff, K. (2003) Many cuts to ruin: a comprehensive update of caspase substrates. Cell Death Differ. 10(1), 76-100. 13. Fulginiti, V.A. (2003) Risks of smallpox vaccination. JAMA 290(11), 1452; author reply 1452. 14. Ghobrial, I.M., Witzig, T.E. a Adjei, A.A. (2005) Targeting apoptosis pathways in cancer therapy. CA. Cancer J. Clin. 55(3), 178-94. 15. Girgis, N.M., Dehaven, B.C., Fan, X., Viner, K.M., Shamim, M. a Isaacs, S.N. (2008) Cell surface expression of the vaccinia virus complement control protein is mediated by interaction with the viral A56 protein and protects infected cells from complement attack. J Virol 82(9), 4205-14. 16. Graham, S.C., Bahar, M.W., Cooray, S., Chen, R.A., Whalen, D.M., Abrescia, N.G., Alderton, D., Owens, R.J., Stuart, D.I., Smith, G.L. a Grimes, J.M. (2008) Vaccinia virus proteins A52 and B14 Share a Bcl-2-like fold but have evolved to inhibit NF-kappaB rather than apoptosis. PLoS Pathog 4(8), e1000128. 34 17. Green, D.R. a Kroemer, G. (2004) The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science 305(5684), 626-9. 18. Guo, Z.S., Naik, A., O'Malley, M.E., Popovic, P., Demarco, R., Hu, Y., Yin, X., Yang, S., Zeh, H.J., Moss, B., Lotze, M.T. a Bartlett, D.L. (2005) The enhanced tumor selectivity of an oncolytic vaccinia lacking the host range and antiapoptosis genes SPI-1 and SPI-2. Cancer Res 65(21), 9991-8. 19. Harlow, E. a Lane, D. (1988) Immunoblotting. In: E. Harlow a D. Lane (Eds), Antibodies: A Laboratory Manual, pp. 471-510. Cold Spring Harbor New York. 20. Humlova, Z., Vokurka, M., Esteban, M. a Melkova, Z. (2002) Vaccinia virus induces apoptosis of infected macrophages. J. Gen. Virol. 83(Pt 11), 2821-32. 21. Chang, H.Y. a Yang, X. (2000) Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64(4), 821- 46. 22. Johnston, J.B. a McFadden, G. (2003) Poxvirus immunomodulatory strategies: current perspectives. J Virol 77(11), 6093-100. 23. Kalbacova, M., Spisakova, M., Liskova, J. a Melkova, Z. (2008) Lytic infection with vaccinia virus activates caspases in a Bcl-2- inhibitable manner. Virus Res 135(1), 53-63. 24. Kalbacova, M., Vrbacky, M., Drahota, Z. a Melkova, Z. (2003) Comparison of the effect of mitochondrial inhibitors on mitochondrial membrane potential in two different cell lines using flow cytometry and spectrofluorometry. Cytometry A 52(2), 110-6. 25. Kalbacova, M., Vrbacky, M., Humlova, Z. a Melkova, Z. (2002) Protooncogene Bcl-2 induces apoptosis in several cell lines. Folia Biol. (Praha) 48(1), 15-27. 26. Kaufmann, S.H., Desnoyers, S., Ottaviano, Y., Davidson, N.E. a Poirier, G.G. (1993) Specific proteolytic cleavage of poly(ADP- ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy-induced apoptosis. Cancer Res. 53(17), 3976-85. 27. Kotwal, G.J., Isaacs, S.N., McKenzie, R., Frank, M.M. a Moss, B. (1990) Inhibition of the complement cascade by the major secretory protein of vaccinia virus. Science 250(4982), 827-30. 28. Krecmerova, M., Holy, A., Pohl, R., Masojidkova, M., Andrei, G., Naesens, L., Neyts, J., Balzarini, J., De Clercq, E. a Snoeck, R. (2007) Ester prodrugs of cyclic 1-(S)-[3-hydroxy-2- 35 (phosphonomethoxy)propyl]-5-azacytosine: synthesis and antiviral activity. J Med Chem 50(23), 5765-72. 29. Kumar, S. (2007) Caspase function in programmed cell death. Cell Death Differ 14(1), 32-43. 30. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(5259), 680-5. 31. Leist, M., Single, B., Castoldi, A.F., Kuhnle, S. a Nicotera, P. (1997) Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J Exp Med 185(8), 1481-6. 32. Locker, J.K. a Griffiths, G. (1999) An unconventional role for cytoplasmic disulfide bonds in vaccinia virus proteins. J. Cell. Biol. 144(2), 267-79. 33. Melkova, Z., Lee, S.B., Rodriguez, D. a Esteban, M. (1997) Bcl-2 prevents nitric oxide-mediated apoptosis and poly(ADP-ribose) polymerase cleavage. FEBS Lett. 403(3), 273-8. 34. Nicotera, P. a Leist, M. (1997) Mitochondrial signals and energy requirement in cell death. Cell Death Differ 4(6), 516. 35. O'Brien, V. (1998) Viruses and apoptosis. J Gen Virol 79 ( Pt 8), 1833-45. 36. Pande, V. a Ramos, M.J. (2003) Nuclear factor kappa B: a potential target for anti-HIV chemotherapy. Curr Med Chem 10(16), 1603-15. 37. Pastoret, P.P. a Vanderplasschen, A. (2003) Poxviruses as vaccine vectors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 26(5-6), 343-55. 38. Rao, R.V., Ellerby, H.M. a Bredesen, D.E. (2004) Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program. Cell Death. Differ. 11(4), 372-80. 39. Safrin, S., Cherrington, J. a Jaffe, H.S. (1997) Clinical uses of cidofovir. Rev Med Virol 7(3), 145-156. 40. Senkevich, T.G., White, C.L., Koonin, E.V. a Moss, B. (2002a) Complete pathway for protein disulfide bond formation encoded by poxviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99(10), 6667-72. 41. Senkevich, T.G., White, C.L., Weisberg, A., Granek, J.A., Wolffe, E.J., Koonin, E.V. a Moss, B. (2002b) Expression of the vaccinia virus A2.5L redox protein is required for virion morphogenesis. Virology 300(2), 296-303. 42. Shisler, J.L., Isaacs, S.N. a Moss, B. (1999) Vaccinia virus serpin-1 deletion mutant exhibits a host range defect characterized by low levels of intermediate and late mRNAs. Virology 262(2), 298-311. 36 43. Schepis, A., Schramm, B., de Haan, C.A. a Locker, J.K. (2006) Vaccinia virus-induced microtubule-dependent cellular rearrangements. Traffic 7(3), 308-23. 44. Schmidtmayerova, H., Alfano, M., Nuovo, G. a Bukrinsky, M. (1998) Human immunodeficiency virus type 1 T-lymphotropic strains enter macrophages via a CD4- and CXCR4-mediated pathway: replication is restricted at a postentry level. J. Virol. 72(6), 4633-42. 45. Schramm, B. a Locker, J.K. (2005) Cytoplasmic organization of POXvirus DNA replication. Traffic 6(10), 839-46. 46. Sliva, K. a Schnierle, B. (2007) From actually toxic to highly specific--novel drugs against poxviruses. Virol. J. 4, 8. 47. Spisakova, M., Cizek, Z. a Melkova, Z. (2009) Ethacrynic and alpha-lipoic acids inhibit vaccinia virus late gene expression. Antiviral Res 81(2), 156-65. 48. Stewart, T.L., Wasilenko, S.T. a Barry, M. (2005) Vaccinia virus F1L protein is a tail-anchored protein that functions at the mitochondria to inhibit apoptosis. J. Virol. 79(2), 1084-98. 49. Stroh, C. a Schulze-Osthoff, K. (1998) Death by a thousand cuts: an ever increasing list of caspase substrates. Cell Death Differ. 5(12), 997-1000. 50. Su, H.P., Lin, D.Y. a Garboczi, D.N. (2006) The structure of G4, the poxvirus disulfide oxidoreductase essential for virus maturation and infectivity. J Virol 80(15), 7706-13. 51. Taylor, J.M. a Barry, M. (2006) Near death experiences: poxvirus regulation of apoptotic death. Virology 344(1), 139-50. 52. Taylor, J.M., Quilty, D., Banadyga, L. a Barry, M. (2006) The vaccinia virus protein F1L interacts with Bim and inhibits activation of the pro-apoptotic protein Bax. J. Biol. Chem. 281(51), 39728-39. 53. Vrbacky, M., Krijt, J., Drahota, Z. a Melkova, Z. (2003) Inhibitory effects of Bcl-2 on mitochondrial respiration. Physiol. Res. 52(5), 545-54. 54. Wasilenko, S.T., Stewart, T.L., Meyers, A.F. a Barry, M. (2003) Vaccinia virus encodes a previously uncharacterized mitochondrial- associated inhibitor of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100(24), 14345-50. 55. WHO. (1980) Wkly. Epidem. Rep. - Releve Epidem. Hebd. WHO. 55. May 16, 1980. 37 8. Publikácie Spisakova, M., Cizek, Z. a Melkova, Z. (2009) Ethacrynic and alpha-lipoic acids inhibit vaccinia virus late gene expression. Antiviral Res 81(2), 156-65. IF: 3.613 * Kalbacova, M., Spisakova, M., Liskova, J.,Melkova, Z., 2008. Lytic infection with vaccinia virus activates caspases in a Bcl-2-inhibitable manner. Virus Res. 135, 53-63. IF: 2.429 * Martina Spišáková, Marie Kalbáčová, Jana Lišková and Zora Mělková: Caspase activation during lytic infection by Vaccinia virus. New frontiers in the research of PhD students: Conference of Medical Schools in the Czech and Slovak Republics: Hradec Králové, December 8-9.2005, p.73-76. 38
Abstract v angličtině:
Univerzita Karlova v Praze 1. lékařská fakulta PhD Thesis Autoreport Character of the host cell death induced by vaccinia virus and inhibitory effects of the lipoic acid on vaccinia virus growth Mgr. Martina Spišáková Praha 2010 Doktorské studijní programy v biomedicíně Univerzita Karlova v Praze a Akademie věd České republiky Obor: Buněčná a molekulární biologie, genetika a virologie Předseda oborové rady: Prof. RNDr. Stanislav Zadražil, DrSc. Školicí pracoviště: Ústav imunologie a mikrobiologie 1.LF UK Autor: Mgr. Martina Spišáková Školitel: MUDr. Zora Mělková, PhD. Oponenti:…… …… …… Autoreferát byl rozeslán dne .. Obhajoba se koná dne…..….v …………..hod. kde …… S disertací je možno se před obhajobou seznámit na oddělení pro vědeckou činnost a zahraniční styky děkanátu 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze. 2 Content Content ..3 Súhrn ..4 Summary ..5 2. Aims and hypothesis ..14 3. Material and methods ..14 5. Discussion..26 6. Conclusions ..31 7. References ..33 8. Publications ..37 3 Súhrn Vírus vakcínie je typickým zástupcom poxvírusov. V minulosti bol ako vakcína používaný na úspešnú eradikáciu pravých kiahní (ang. smallpox). V súčasnosti je používaný ako vektor pre profylaktické aj experimentálne účely. Táto dizertačná práca nadväzuje na výsledky publikovaných prác z nášho laboratória a je zčasti zameraná na bližšie charakterizovanie vplyvu infekcie vírusom vakcínie na typ bunkovej smrti hostiteľskej bunky. Výsledky ukazujú na to, že počas infekcie vírusom vakcínie sa aktivujú dráhy apoptózy, apoptóza ale nie je dokončená a bunka umiera nekroticky. V našich pokusoch sme farmakologickou inhibíciou aktivity enzýmu PARP (Poly-(ADP-ribóza) polymeráza) nedokázali zmeniť formu bunkovej smrti indukovanú vírusom vakcínie z nekrózy na apoptózu. Efekty anti-apoptotických faktorov kódovaných vírusom vakcínie pravdepodobne hrajú významnejšiu úlohu. Ďalšia časť práce sa venuje sledovaniu inhibičného efektu redox-modulujúcej látky, kyseliny lipoovej, na infekciu vírusom vakcínie. Výsledky ukázali jej inhibičný vplyv v bunkových líniach rôzneho embryonálneho pôvodu. Naše výsledky ukazujú na to, že inhibičný efekt kyseliny lipoovej je na úrovni expresie neskorých génov alebo morfogenézy vírusových častíc. Kyselina lipoová tak ponúka možnosť použitia ako podpornej látky pri liečbe infekcie poxvírusmi. 4 Summary Vaccinia virus is a typical member of the poxvirus family. It had been successfully used during the worldwide smallpox eradication campaign. Currently, it is used as vector for prophylactic, as well as experimental purposes. This PhD thesis stems from the findings previously published in our lab. It is partially focused on a further characterization of vaccinia virus effects on the type of host cell death. The results point to the activation of apoptosis during vaccinia virus infection, but it cannot be completed and the cell dies by necrosis. Our attempts to shift the necrotic type of cell death induced by vaccinia virus infection towards apoptosis using a pharmacological inhibition of activity of a key enzyme PARP (Poly-(ADP-ribose) polymerase) remained unsuccessful. The effects of vaccinia virus-encoded anti- apoptotic factors appear superior to the inhibition of this single enzyme. The second part of the thesis is focused on inhibitory effects of a redox-modulating compound, lipoic acid, on vaccinia virus infection. Our results demonstrated its inhibitory effects in cell lines of different embryonic origin. It appears that the lipoic acid inhibits vaccinia virus growth at the stage of late gene expression or possibly later, during virus morphogenesis. Lipoic acid could be potentially used as a supportive treatment in therapy of a poxvirus infection. 5 1. Introduction 1.1 Vaccinia virus Vaccinia virus (VACV) is a typical member of the poxvirus family. VACV genome consists of one molecule of dsDNA, approximately 195 kb long that encodes about 200 proteins. VACV replication takes place in the host cell cytoplasm. VACV has been widely used because of its properties like high stability, easy and inexpensive preparation, ability to induce robust and long-lasting humoral and cellular immune responses together with a capacity to integrate big portions of DNA. It serves as a constituent of several recombinant vaccines and vectors, and it also offers opportunity for the study of host cell interactions (Condit andNiles, 2002; Pastoret andVanderplasschen, 2003). Thanks to these properties VACV was successfully used during the worldwide smallpox eradication campaign (Buller andPalumbo, 1991). VACV is morphologically one of the largest viruses. It produces two major infectious forms, intracellular mature virion (IMV) and extracellular enveloped virion (EEV; (Schepis et al., 2006). The VACV virion core is released after virus entry into the cell. Almost immediately after the entry, transcription of about 100 different molecules of early mRNA’s occurs, employing the transcriptional apparatus included in the virion. Early mRNA’s are then released into the cytoplasm and viral proteins are synthesized (Schramm andLocker, 2005). Viral DNA replication is independent of the host cell nucleus and it takes place in the cytoplasm parts called virosomes or viral factories. After DNA replication, synthesis of mRNA’s encoded by the intermediate genes 6 occurs (Baldick andMoss, 1993). Consequently, expression of VACV late genes takes place. Some of the late proteins are then glycosylated, phosphorylated and cleaved before or during their incorporation into virus particles (Buller andPalumbo, 1991). Assembly of viral particles is complex. Stepwise, structural proteins, enzymes and viral DNA are surrounded by immature viral membranes. Subsequently, virions are transported from the cytoplasm. 1.2 Effect of the vaccinia virus infection on the host cell metabolism VACV, like a typical poxvirus, causes a cytopathic effect of the host cells, the nature of which is dependent on the type and origin of the host cell. There are significant changes in the metabolism of host cells during VACV infection. Host cell DNA synthesis is inhibited soon after the entry of the virus and the host DNA is hydrolysed by an endonuclease present in the virion. Host cell RNA synthesis and processing is also inhibited, but it occurs only after viral protein synthesis. The host mRNA half-life, as well as the viral RNA, is decreased during the course of VACV infection. VACV itself inhibits also the host protein synthesis by various mechanisms. The rate of inhibition depends on the type of infected cell and the multiplicity of infection (Buller andPalumbo, 1991). On the other hand, VACV infection is in turn affected by the the energy metabolism of the host cell (Vrbacky et al., 2003). 7 1.3 Virus interaction with the host cell defense system The poxviruses are successful pathogens thanks to several mechanisms, which help them to resist and overcome host cell defense system. VACV has developed a strategy against the host complement system. VCP, VACV complement control protein, is a 35-kDa protein secreted by VACV-infected cells that inhibits activation of the classical complement cascade (Girgis et al., 2008; Kotwal et al., 1990). Poxviruses overcome the host interferon (IFN) system by secretion of soluble homologues of IFN receptors. Those receptors are highly species-specific. VACV expresses a B8R binding to human and rat but not mouse IFNγ, and B18R binding to IFN α/β of several species (Alcami andSmith, 1995). In addition, VACV also interferes with the effector phase of the interferon- inducible defense mechanisms (e.g. inhibitors encoded by the E3L and K3L genes (Johnston andMcFadden, 2003). Similarly, proteins encoded by VACV affect other parts of the IFN pathways. H1L gene of VACV expresses phosphatase, which inhibits IFN-induced activation of the transcription factor STAT-1. Products of VACV genes A46R and A52R contain domains homologous to the Toll-like/IL-1 receptor, enabling them to interrupt IL-1 signaling pathway and inhibit NF-κB activation induced by IL-1 (Johnston andMcFadden, 2003). 1.4 Apoptosis A programmed cell death – apoptosis, plays an important role in the elimination of infected cells. The infected cells are controlled by two mechanisms directing them to apoptosis. The first mechanism consists in the presentation of viral 8 peptides on the surface of infected cells in complex with the major histocompatible antigens. The complex is then recognized by cytotoxic T lymphocytes that induce apoptosis of the infected cells. The second mechanism is linked to the control of viral infection by the cell itself. The cell detects a virus-induced activation of the cell cycle proteins and starts the process of apoptosis through the p53 protein (O'Brien, 1998). Cascade cleavage and activation of caspases, cysteine proteases, is a central process of apoptosis (Kumar, 2007). Caspases are involved in the initiation and effector phases of apoptosis (caspases 8, 9, 10, and caspases 3, 6, 7, respectively). The efector caspase action results in cleavage of several cellular proteins, leading to the cell death. Caspase or death substrate cleavage is then responsible for the execution of apoptosis, including the morphological changes (Fischer et al., 2003). Apoptosis can be triggered by extracellular or intracellular signals. The extracellular receptor pathway is activated by a death ligand binding to the corresponding cell death receptor. The binding is followed by a signal transduction via adapter proteins and subsequently activation of caspase 8. Active caspase 8 may activate effector caspase 3 directly or via protein Bid and mitochondria (Danial andKorsmeyer, 2004). The intracellular apoptotic pathway is initiated by stress signals leading to mitochondrial permeability transition and the release of cytochrome c and/or apoptosis inducing factor (AIF). The release of cytochrome c leads through its interaction with the adapter molecule Apaf-1 to the activation of caspase 9 in apoptosome, resulting in the activation of effector caspases (Ghobrial et al., 2005). 9 A third, newly described, apoptotic pathway is initiated in the endoplasmic reticulum (ER). Changes in Ca2+ ion homeostasis and accumulation of the missfolded proteins leads to the ER stress, which may result in the activation of caspase 12, leading to the activation of caspase 9 (Rao et al., 2004). Mitochondria represent a key checkpoint in apoptosis. Induction of apoptosis leads to the reduction of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and release of many pro-apoptotic factors (Green andKroemer, 2004). Release of these factors from mitochondria is strictly regulated by proteins of the Bcl-2 family. Poxviruses have developed several mechanisms to interfere with the processes of apoptosis directly or indirectly. They encode a first inhibitor caspases to be described, CrmA (Taylor andBarry, 2006). This protein, also known as SPI-2 (serin protease inhibitor 2), inhibits caspase 1 and 8. Its homologue SPI-1 prevents apoptosis by binding to catepsin G (Guo et al., 2005; Shisler et al., 1999). Several other proteins that interfere with apoptosis are encoded by VACV. Among them, F1L is unique for its inhibition of the loss of ΔΨm and the release of cytochrome c from mitochondria provoked by various inducers of apoptosis. A possible mechanism of its anti-apoptotic action consists in the interaction with BH3- proteins of the Bcl-2 family (Stewart et al., 2005; Wasilenko et al., 2003). 1.5 Vaccinia virus-encoded redox system Certain VACV-encoded proteins contain stable disulfide bonds in their domains. The disulfide bonds formation occurs through the virus-encoded redox pathway in the host cell cytoplasm. The importance of this pathway for a successful virus replication has been demonstrated by disabling each of 10 its three key protein constituents, resulting in the inability to form viral particles in each case (Senkevich et al., 2002a; Su et al., 2006). 1.6 Smallpox virus – potential for misuse Initial attempts to protect against smallpox date back to the ancient Egypt. In the 18th century, Edward Jenner introduced vaccination (Lat. vacca = cow) consisting in the application of the material from the cowpox lesions as a preventive measure against smallpox. VACV became the invariable part of the smallpox vaccines only at the end of the 19th century. Vaccination with various strains of this virus enabled smallpox eradication by 1980 (WHO, 1980). Since then, vaccination of the general population was stopped. However in recent years, a threat of a potential misuse of smallpox as a biological weapon appeared. Due to the lack of immunity in the general population, high transmissibility of variola and mortality on the disease, the impact of smallpox release in today's population would be much more disastrous than in the past century. On the other hand, vaccination with VACV is associated with a risk of side effects higher than any other vaccine and they are 10-times more likely to occur in the first-time adult vaccinees, which is an obstacle to reintroduction of vaccination. In addition to misuse of poxviruses as biological weapons, there is also a threat emerging from the natural environment. Monkeypox virus causes a disease in human that is similar to smallpox. 11 1.7 Post-vaccination complications caused by vaccinia virus Post-vaccination complications caused by VACV relate mainly to the excessive VACV multiplication at the vaccination site or in other parts of the body. The most frequent complication consists in an occasional inoculation in other parts of the skin due to virus transfer from the vaccination site. Generalized vaccinia, a condition when the virus spreads by blood and the pustules appear on distant parts of the body, is less common but usually without further complications. Both forms could result in serious consequences in immunocompromised individuals, though. Serious complications of vaccination occur mostly in people with deffects in natural or specific immunities and they include eczema vaccinatum, progressive vaccinia and post-vaccination encephalitis. Other complications comprise fetal vaccinia, skin erythema, myopericarditis and bacterial superinfections (Bray, 2003; Fulginiti, 2003). 1.8 Therapy of postvaccination complications caused by vaccinia virus No specific therapy for postvaccination complications associated with VACV vaccination was available until the 50- thies when VACV immunoglobulin and tiosemicarbozone derivatives were introduced. During many years of research, VACV used to be included among viruses that were tested for sensitivity to different kinds of chemicals. Most of the substances that have proven efficacy against VACV are nucleoside analogues. The only substance approved by the U.S. FDA for the treatment of VACV postvaccination complications, cidofovir (Vistide ®, HPMPC) was discovered 12 by prof. Holý and it belongs also to a group of nucleoside analogues (De Clercq et al., 1986). The disadvantage of cidofovir is an intravenous administration and nephrotoxicity (Safrin et al., 1997). However, the unique antiviral activity of cidofovir led to a development of its oral form CMX001 (Sliva andSchnierle, 2007) and other derivatives (Krecmerova et al., 2007). Recently described substances active against VACV include also those that inhibit its spread: Gleevec (STI-571, Glivec) and ST-246 (Sliva andSchnierle, 2007). 1.9 Redox-modulating agents Part of this work is focused on inhibitory effects of thiol- reactive substances on VACV growth and replication, in particular, on lipoic acid. Lipoic acid (LA) is a disulfide derivative of the octanoic acid, which forms intramolecular disulfide bond in its oxidised form. Inside the cell, a probable site of LA synthesis and action are mitochondria (Bilska andWlodek, 2005). Increased interest of current medicine in this substance results from its unique reduction capacity. Reduced LA participates in the neutralizing reactions of oxygen radicals, as well as in the reducing reactions of oxidized forms of other antioxidants. In addition, LA has another special feature – it is soluble not only in the water but also in fat. All these features contribute to the fact that LA is often called "the antioxidant of antioxidants" (Bilska andWlodek, 2005). Currently, LA raises considerable interest for its therapeutic use and positive impact on the treatment of several diseases such as diabetes, atherosclerosis, degenerative nerve disease or AIDS (Bilska andWlodek, 2005). 13 It has been shown that the LA inhibits HIV replication by preventing activation of NFκB in cell cultures (Pande andRamos, 2003). 2. Aims and hypothesis In this work, we focus on further elucidation of previously published findings showing activation of caspases during VACV infection and on the effects of redox-modulating agents on the VACV infection. Specific aims of the work: 1. Analysis of the protease substrates cleaved during VACV infection. 2. Study of the inhibition of caspase and PARP activities and the effects on VACV infection. 3. Preparation of cell lines with an inducible expression of Bcl-2 and analysis of effects of the expressed Bcl- 2. 4. Characterization of the effect of redox-modulating agents, especially LA, on VACV infection. 3. Material and methods Chemicals. All cultivature media and growth supplements used were from Invitrogen, Gibco or PAA Laboratories. Other chemicals were from Sigma, Fluka, Promega, R&D Systems, Applied Biosystems and Molecular Probes. Cell lines. The following cell lines were used in experiments: human epithelial cell line HeLa-G, green monkey kidney cell line BSC-40, mouse fibroblast cell line L929, 14 mouse monocyte/macrophage cell line J774.G8 and human cell line Jurkat. Preparation and screening of stably transfected cell lines. Preparation of stably transfected cell lines was performed according the Tet-On transfection system manufacturer protocol. The Superfect (Qiagen) was used as a transfection agent. Stably transfected cell lines were selected with G.418 and hygromycin, respectively. Transfected cells were screened using determination of luciferase activity after transient transfection of a reporter plasmid or using western blot analysis. Viruses. Wild-type VACV (WT-VACV), strain Western Reserve (WR; ATCC VR-119) and recombinant VACV expressing chloramphenicol acetyltransferase (CAT), Bcl-2, PKR, inducible NO-synthetase (iNOS) and luciferase (Luc) were used in the experiments. Flow cytometry. The flow cytometer FACScan (Beckton Dickinson) was used for flow cytometric analyis. Data analysis was performed using the software WinMDI v2.8. Fluorescence microscopy. Cultured cells were examined directly in culture plates using an inverse fluorescence microscope Olympus IX-70. Western blot. SDS-PAGE a Western blotting were performed in accordance with published protocols (Ausubel et al., 2002; Harlow andLane, 1988; Laemmli, 1970). DNA isolation and real-time PCR. For real-time PCR analysis, the cells were prepared according to a published protocol (Schmidtmayerova et al., 1998). Viral DNA was quantified using the Applied Biosystems 7300 Real-time PCR System. Primers and probes were prepared by Applied Biosystems as Custom TaqMan® Gene Expression Assay. Primers set and probe were selected for the terminal part of 15 VACV genome. Results were analyzed by the Sequence Detection Software (Applied Biosystems). Statistics. Results were presented as averages +/- S.E.M. (standard error of mean). Statistical differences within the single group were calculated using ANOVA. Statistical differences between the group and controls or between the two different groups were analyzed by Student t-test. 4. Results 4.1. Lytic cell death in vaccinia virus-infected cells VACV causes lysis, an equivalent of necrosis, in most of the infected cells. Bcl-2 expressed by VACV reveals two opposite effects repeatedly described in the past: it shows a typical anti-apoptotic effect in Hela G cells, while it induces apoptosis in BSC-40 cells. (Kalbacova et al., 2008; Kalbacova et al., 2003; Melkova et al., 1997; Vrbacky et al., 2003). These results were confirmed also in this work (Kalbacova et. al. 2008). 4.2. Caspase activity during a lytic infection with vaccinia virus Caspase activation and/or activity detected by flow cytometry were observed in VACV-infected HeLa G and BSC- 40 cells (Kalbacova et al., 2008; Kalbacova et al., 2003). As these earlier results were obtained only from infectious experiments, we decided to supplement them and compare with those obtained after induction of apoptosis with non-infectious inducers under the same experimental conditions. Based on our results, we can conclude that the induction of apoptosis by ionomycin and staurosporine caused 16 significantly increased caspase activation/activity. The level of activation and activity of caspases in this non-infectious model was comparable to the levels found in both VACV-infected cell lines tested (Kalbacova et al., 2008). 4.3. Cleavage of caspase substrates during vaccinia virus infection To supplement the flow cytometric measurements, we decided to characterize caspase activity using western blot analysis of caspase substrates cleavage. 4.3.1. Cytokeratin 18 First, we examined a cleavage of cytokeratin 18. An obvious decrease in levels of the whole-size cytokeratin 18 was observed in VACV infected Hela G cells and BSC-40 cells (Fig. 1). We can conclude that infection with both VACV recombinants used led to the reduction in cytokeratin 18 levels in both tested cell lines. Fig. 1. Western blot analysis of the cytokeratin 18 cleavage in VACV- infected cells. 4.3.2. Actin Actin, one of the cell cytoskeleton components, is also a caspase substrate. Its cleaved fragments contribute to the changes of apoptotic cell morphology (Chang andYang, 2000; Stroh andSchulze-Osthoff, 1998). 17 Infection with both VACV recombinants tested results in a decrease of actin levels in Hela G cells at 24 h.p.i. VACV infection has not led to changes in actin levels in BSC-40 cells (Fig. 2). Fig. 2. Western blot analysis of the actin cleavage in VACV-infected cells. 4.3.3. PARP We further analyzed a cleavage of the poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) protein, a typical caspase substrate. PARP is inactivated by cleavage to an 85 kDa fragment during apoptosis (Kaufmann et al., 1993). No significant PARP cleavage was found in VACV- infected Hela G cells in comparison with uninfected controls (Fig. 3). Similarly, PARP was not cleaved in uninfected nor VACV-CAT-infected BSC-40 cells. In contrast, the 85 kDa PARP cleavage fragment was detected in VACV-Bcl-2- infected BSC-40 cells. This finding is consistent with the apoptotic morphology of these cells detected since 12 h.p.i. The obtained results show that the cleavage of PARP typical for apoptotic cells was observed only in those VACV- infected cells that exhibit morphological signs of apoptosis. Fig. 3. Western blot analysis of the PARP cleavage in the VACV-infected cells. 18 4.4. Effect of the caspase inbition on vaccinia virus infection Based on our previous results, it seems possible to suggest that caspases might have a special role during the VACV infection. Therefore we decided to characterize the effect of caspase inhibition on VACV infection. Fig. 4 shows that the administration of a pan-caspase inhibitor z-VAD-FMK did not reveal any statistically significant effect on VACV growth in Hela G nor BSC-40 cells. Fig. 4. Effect of a pan-caspase inhibitor z-VAD-FMK on VACV growth. Additional analysis of the cleavage of cytokeratin 18 in the presence of z-VAD-FMK shows that cytokeratin 18 is most likely cleaved by proteases other than caspases. 4.5. Effect of PARP inhibition on vaccinia virus infection Based on the previous results, we can speculate that there is a shift in the type of the on-going cell death during VACV infection. The apoptotic program at the beginning of infection, demonstrated by caspase activation, seems to change and continue as necrosis. It is possible that this change occurs because of a reduced availability of energy supplies. PARP 19 cleavage is a critical event that decides whether the cellular signals link to apoptosis or necrosis (Nicotera andLeist, 1997). PARP activation leads to a reduction of available ATP, which results in necrosis. In contrast, when PARP is cleaved, sources of ATP are preserved and the cell has enough energy for the process of apoptosis. As PARP remains uncleaved during the infection with VACV, it is likely to be active. Its pharmacological inhibition could therefore result in preservation of ATP and increased chances of the cell to execute apoptosis. To examine the effects of PARP inhibition on VACV- induced type of cell death, we used a potent PARP inhibitor PJ 34. We did not observe any changes in PARP cleavage in infected cells treated with the inhibitor. On the contrary, we observed a significant cleavage of cytokeratin 18 in Hela G cells infected with VACV and treated with PJ 34. As VACV infection induces a decrease of ΔΨm and/or a decrease of total cellular levels of ATP, changes in mitochondrial function were also analyzed in the presence of PJ 34. However, addition of the PARP inhibitor during VACV infection had no significant effect on the changes of ΔΨm induced by VACV. In summary, we were not able to demonstrate any significant effects of PARP inhibition on VACV infection and the type of cell death in our experiments. VACV-encoded anti- apoptotic activities probably affect the cell death machinery more strongly and their role is superior to the effects of PJ 34. 4.6. Stably transfected cell lines A unique pro-apoptotic activity of the protooncogene Bcl-2 expressed by VACV (Kalbacova et al., 2008; Kalbacova et al., 2002) can consist in the properties of the protein itself or in its behavior and/or interactions in a specific cellular 20 environment, but also in the type of the expression system. We have therefore tried to examine the behavior of Bcl-2 using its expression using the expression system other than VACV. We have chosen the Tet-On system, which should allow a high level of induction of expression compared to the basal conditions and a tight concentration-dependent regulation. 4.6.1. Effect of the inducible expression of Bcl-2 on BSC- 40 cells and their infection with vaccinia virus We have generated a stably transfected BSC-40 cell line expressing Bcl-2 under the inducible promoter Tet-On. However, the induction of expression of Bcl-2 did not lead to any significant morphological changes in the stably transfected BSC-40 cell line and the cells revealed a typical morphology similar to the parental BSC-40 cells. We also analyzed the effect of Bcl-2 expression on the VACV infection. The plasma membrane integrity analysis by flow cytometry shows changes typical for the lytic VACV infection. However, we did not observe any significant changes due to the inducible Bcl-2 expression by the Tet-On system. Similarly, we did not experience any significant changes in ΔΨm after inducible Bcl-2 expression. Based on our results, we can conclude that in our experimental conditions and at the levels of expression achieved using the Tet-On expression system, expression of Bcl-2 had no significant effect on the stably transfected BSC- 40 cell line morphology nor the VACV infection. 21 4.7. Effect of redox-modulating agents on vaccinia virus infection The VACV structure is dependent on the disulfide bonds which are formed during the virion morphogenesis by several VACV redox proteins (Locker andGriffiths, 1999; Senkevich et al., 2002a; Senkevich et al., 2002b). It is possible that agents affecting the redox environment of infected cells could also affect the VACV infection. 4.7.1. Effect of different redox-modulating agents on vaccinia virus infection We analyzed the effect of five different redox- modulating agents (β-mercaptoethanol, DTT, ascorbic acid, LA and Ethacrynic acid) on the VACV infection in our experiments (Spisakova et al., 2009). First, we analyzed the effect on the growth of VACV characterized by luciferase activity in cells infected with VACV expressing luciferase (Fig. 5). We measured a statistically significant increase of luciferase activity for the three agents tested - β- merkaptoethanol, DTT and ascorbic acid. Other two substances, LA and ethacrynic acid, resulted in a statistically significant reduction in luciferase activity. 22 Fig. 5. Effect of different redox-modulating agents on VACV infection. Based on these results we decided to further characterize the inhibitory effect of LA on VACV infection. In a series of experiments with LA, we experimentally confirmed its inhibitory effect on the growth of VACV in cell lines of different origin. 4.7.2. Effect of the lipoic acid on the early and late vaccinia virus genes expression First, we characterized in which phase of VACV growth cycle inhibitory effects of LA occur. To distinguish the effect on the synthesis of VACV either early or late genes, VACV recombinants expressing luciferase under two different VACV promoters (early/late - VACV E/L, and late - VACV L) were used. A DNA polymerase inhibitor, cytosine arabinoside (Ara C), was also added to the experimental samples. As Ara C inhibits VACV DNA synthesis, expression of VACV late proteins does not occur. Therefore in the presence of Ara C, we have determined activity of luciferase expressed only under control of the VACV early promoter. 23 The results showed that LA had no inhibitory effect on the VACV early gene expression, while the late gene expression was blocked (Fig. 6). Fig. 6. Effect of the LA on VACV early and late gene expression. 4.7.3. Effect of the lipoic acid on the overall vaccinia virus protein expression In another series of experiments, we analyzed the effect of LA on the overall expression of VACV proteins in HeLa G cells using western blot analysis. Addition of 250 and 500 µM LA revealed no visible effect on the distribution or levels of VACV proteins in both VACV recombinants tested. We observed only a slight decrease of viral protein levels in the presence of 1 mM LA. Based on these results, we can conclude that LA affects VACV growth cycle at the level of viral DNA synthesis, viral late gene expression or virion morphogenesis. 24 4.7.4. Effect of the lipoic acid on vaccinia virus DNA replication The effect of LA on VACV DNA replication was analyzed by the real-time PCR. The results in Fig. 7 show that LA does not inhibit viral DNA synthesis. On this basis, it can be concluded that LA exerts its effect at the later stages of the VACV growth cycle, i.e. at the level of VACV late gene expression or morphogenesis. Fig. 7. Effect of the LA on VACV DNA synthesis. 4.7.5. Effect of the lipoic acid on vaccinia virus infection depending on the time of addition Finally, we decided to confirm the stage of VACV growth cycle by adding the LA at different times after infection. Fig. 8 shows a strong inhibitory effect of LA on the VACV infection when added at or before 4 h.p.i., which is a time when viral DNA synthesis starts. Lower, but also statistically significant inhibition was observed when the LA was added at 8 h.p.i. As the viral DNA replication should be over at this time post infection, the results further support the previous conclusion that LA inhibits VACV growth at the level of the late gene expression. 25 Fig. 8. Effect of the LA on VACV infection depending on the time of its addition. In conclusion, we have demonstrated the inhibitory effect of LA on VACV growth in cell lines of different origin. According to our results, the inhibition takes place at later stages of VACV growth cycle - at the level of VACV late gene expression or possibly at the stage of virion morphogenesis. 5. Discussion 5.1. Type of cell death induced by vaccinia virus infection VACV causes lysis in the most of infected cells. This type of cell death is considered as equivalent to necrosis. Morphology of infected epithelial cells used in our experiments confirms the necrotic type of cell death. The exception is the apoptosis induced after VACV-Bcl-2 infection of BSC-40 cells. However, this is a previously described phenomenon induced by VACV-driven overexpression of Bcl- 2 in these cells. Necrosis and apoptosis differ in several morphological and biochemical processes. The most typical for apoptosis, but not for necrosis, is the activation of caspases. My predecessor and colleague in the lab, Marie Kalbáčová, observed the activation of caspases during the lytic infection 26 with VACV (Kalbacova et al., 2008). Based on these unexpected findings, we decided to further analyze the type of cell death caused by VACV infection. The cleavage of specific caspase substrates in VACV infected cells was studied by Western blotting. Our results confirmed the cleavage of cytokeratin 18 during the lytic infection with VACV in both cell lines tested, while opposite results were observed in case of PARP. We did not observe any PARP cleavage in either of VACV infected cell lines. Therefore, we can assume that PARP is active in these cells and participates in the consumption of cellular ATP, leading to the necrosis of infected cells. However, the reasons why cytokeratin 18 is cleaved during the infection with VACV, while PARP remains uncleaved, remain to be explained. Thus, it seems that apoptosis is activated during the infection with VACV, but it can not be completed and the cell dies due to necrosis. A possible explanation may consist in the initiation of the apoptotic program by infection with VACV, but soon after, the apoptosis is inhibited by various caspase inhibitors and other proteins affecting apoptosis that are encoded and expressed by VACV (Stewart et al., 2005; Taylor et al., 2006; Wasilenko et al., 2003). VACV infection results in apoptosis in certain immune cell types (macrophages, dendritic cells and B lymphocytes) (Baixeras et al., 1998; Engelmayer et al., 1999; Humlova et al., 2002). In these cases, apoptosis might probably serve as a strategy how to overcome immune defense mechanisms of the host. These examples also suggest that in some cases, sufficient energy supplies to execute apoptosis might be present . 27 5.1.1. Effect of caspase inhibition on vaccinia virus infection Based to our results, it is possible to expect that caspase activation might play some role during the infection with VACV. Therefore we decided to analyze the possible effect of caspase inhibition on VACV infection. However, the results obtained revealed only a marginal affect of a pan-caspase inhibitor on VACV growth. Unexpectedly, we observed a more pronounced reduction in levels of the whole-size cytokeratin 18 after the inhibition of caspases. Therefore, it seems that cleavage of cytokeratin 18 could be executed also by proteases other than caspases. 5.1.2. Effect of the PARP inhibition on the cell death induced by Vaccinia virus The intracellular pool of ATP is one of the key determinants of the cell death type. It has been shown that if the level of ATP was reduced, a typical apoptotic stimulus resulted in necrosis (Leist et al., 1997). PARP plays an important role in consumption of ATP, and it is likely to be activated due to VACV-induced DNA damage. Therefore, our aim was to prevent the enzymatic activity of PARP by a specific PARP inhibitor PJ 34, and thus save energy supplies for the processes of apoptosis. However using western blot analysis, we did not observe any changes either in levels of PARP or in its cleavage in VACV-infected cells treated with PARP inhibitor. There were no morphological signs of apoptosis either. In the experiments performed, it is likely that PARP activity was inhibited, but a pharmacological inhibition of this single protein was not sufficient to change the type of cell death. In summary, a contribution of various 28 VACV-encoded inhibitors of apoptosis is probably superior to the effect of PJ 34. 5.2. Stably transfected cell lines Upon expression of a particular recombinant protein by VACV, virus interactions with the protein itself and/or with the host cell also play an important role. The observed effects of Bcl-2 protein expressed by VACV differ in dependence on the host cell type and metabolism. Therefore, we decided to use another expression system for its expression to distinguish the effects caused by the interactions of Bcl-2 and VACV from the effect of a different intracellular microenvironment. After a successful preparation of the cell line BSC-40 expressing Bcl-2 under control of a promoter inducible by doxycycline, we characterized the effects of Bcl-2 on the processes of apoptosis. The experiments performed did not prove any effect of the expressed Bcl-2 on cell morphology, changes of metabolism or VACV infection in stably transfected cell lines. However, further characterization of the effects caused by Bcl-2 overexpression was hampered by low and decreasing levels of Bcl-2 expression. The increased expression of Bcl-2 is probably detrimental for BSC-40 cells, which is in line with the observed apoptosis of BSC-40 cells infected with VACV-Bcl-2. The reason why we did not observe any effects of Bcl-2 expressed by stably transfected cell lines could consist in a lower level of its expression compared to the VACV expression system. Therefore, it might be more appropriate to use a stronger expression system, e.g. adenovirus, to study the effects of Bcl-2 independently of VACV. 29 5.3. Effect of the redox-modulating agents on the growth of vaccinia virus We focused on the characterization of redox-modulating agents, especialy LA, on the growth of VACV. First, we experimentally analyzed the effect of five different redox- modulating agents, β-merkaptoethanol, DTT, ascorbic acid, LA and EA, on VACV infection. We have observed an inhibitory effect only after the treatment with LA and EA. The effects were concentration-dependent and the LA was effective in high micromolar range. The mechanism of the LA-mediated inhibitory effect could consist in the interference with disulfide bond formation and/or exchange or with redox cycling of a thioredoxin, glutaredoxin, or similar compounds. LA could directly target VACV redox-dependent proteins or change the intracellular redox potential. VACV morphogenesis is dependent on a cytoplasmic redox pathway encoded by VACV that consists in a sequential disulfide bond formation. The change in function of any of the three key virus proteins results in an incorrect virus maturation (Su et al., 2006). LA-mediated inhibition of VACV growth could also consist in the inhibition of activation of the transcription factor NF-κB by decreasing levels of oxygen free-radicals. Nevertheless, VACV itself inhibits NF-κB activation and translocation into the nucleus (Graham et al., 2008). In our experiments, we have confirmed the inhibitory effect of LA in cell lines of different embryonic origins. In the same time, the effective concentrations of LA did not reveal any cytotoxic effects in cell lines tested, as assessed by the MTT test. The IC50 of LA ranges in 200-500 μM as determined for VACV titer. Published IC50 values of cidofovir for VACV are 9.8 μM for human embryonic fibroblasts and 54 30 - 62 μM for Vero cells. Although the results obtained by different tests under different conditions can be compared only with some limitations, we realize that LA inhibitory concentrations are probably therapeutically uninteresting. However, our aim was to describe this new inhibitory effect of LA on VACV growth and to further characterize the step in VACV growth cycle that is inhibited. The results showing that LA inhibits VACV late gene expression or possibly a later step in virus morphogenesis point to the new possibilities in the inhibition of poxvirus infection. Despite the high effective concentrations of LA against VACV, it reveals many favorable properties that make it an attractive target worthy of further investigation and development. LA is well absorbed from the intestine, it passes well the blood-brain barrier, it is non-toxic even at high concentrations for most cells, and it is used as a food supplement. Even if LA is not likely to be used as a single therapy of the poxvirus infection, it is possible to imagine that it could serve as a supportive treatment in combination with other antiviral agents. 6. Conclusions This PhD thesis has focused on detailed characterization of the previously demonstrated events in VACV infection and on the presentation and analysis of new inhibitory properties of certain redox-modulating agents. The results can be briefly summarized as follows: 1. In the experiments characterizing cleavage of caspase substrates, we confirmed the cleavage of cytokeratin 18. On the other hand, the cleavage of another caspase substrate, 31 PARP, was not observed. The results point to the activation of apoptosis during the VACV infection. However, apoptosis can not be completed and the cell dies by necrosis. 2. Experiments characterizing the effect of caspase inhibition during VACV infection were performed with a pan- caspase inhibitor z-VAD-FMK. However, this inhibitor revealed only a marginal effect on VACV growth and a more pronounced effect on the cleavage of cytokeratin 18, suggesting that proteases other than caspases can be involved in its cleavage. Attempts to inhibit activity of PARP and thus shift the necrotic type of cell death during VACV infection towards apoptosis remained unsuccessful. The effects of other VACV- encoded anti-apoptotic factors appear superior to the inhibition of PARP activity. 3. We prepared a stably transfected cell line BSC-40 expressing Bcl-2 under control of the inducible Tet-On expression system. In the experiments performed, we did not observe any significant changes in the type of cell death due to Bcl-2 expression. However, further characterization of the effects caused by Bcl-2 overexpression was hampered because of a low and decreasing level of Bcl-2 expression. The increased expression of Bcl-2 is probably detrimental for BSC- 40 cells. 4. In experiments focused on the effects of five redox- modulating agents on VACV growth, we observed a stimulatory effect exerted by -mercaptoethanol, DTT and ascorbic acid, and a concentration-dependent inhibitory effect exerted by lipoic and ethacrynic acids. In this work, we further 32 analyzed the inhibitory effects of LA. It appears that LA inhibits VACV growth at the stage of late gene expression or later during virus morphogenesis. 7. References 1. Alcami, A. and Smith, G.L. (1995) Cytokine receptors encoded by poxviruses: a lesson in cytokine biology. Immunol Today 16(10), 474- 8. 2. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K. (2002) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons. 3. Baixeras, E., Cebrian, A., Albar, J.P., Salas, J., Martinez, A.C., Vinuela, E. and Revilla, Y. (1998) Vaccinia virus-induced apoptosis in immature B lymphocytes: role of cellular Bcl-2. Virus. Res. 58(1- 2), 107-13. 4. Baldick, C.J., Jr. and Moss, B. (1993) Characterization and temporal regulation of mRNAs encoded by vaccinia virus intermediate-stage genes. J Virol 67(6), 3515-27. 5. Bilska, A. and Wlodek, L. (2005) Lipoic acid - the drug of the future? Pharmacol Rep 57(5), 570-7. 6. Bray, M. (2003) Pathogenesis and potential antiviral therapy of complications of smallpox vaccination. Antiviral Res 58(2), 101-14. 7. Buller, R.M. and Palumbo, G.J. (1991) Poxvirus pathogenesis. Microbiol Rev 55(1), 80-122. 8. Condit, R.C. and Niles, E.G. (2002) Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochim Biophys Acta 1577(2), 325-36. 9. Danial, N.N. and Korsmeyer, S.J. (2004) Cell death: critical control points. Cell 116(2), 205-19. 10. De Clercq, E., Holy, A., Rosenberg, I., Sakuma, T., Balzarini, J. and Maudgal, P.C. (1986) A novel selective broad-spectrum anti-DNA virus agent. Nature 323(6087), 464-7. 11. Engelmayer, J., Larsson, M., Subklewe, M., Chahroudi, A., Cox, W.I., Steinman, R.M. and Bhardwaj, N. (1999) Vaccinia virus inhibits the maturation of human dendritic cells: a novel mechanism of immune evasion. J. Immunol. 163(12), 6762-8. 33 12. Fischer, U., Janicke, R.U. and Schulze-Osthoff, K. (2003) Many cuts to ruin: a comprehensive update of caspase substrates. Cell Death Differ. 10(1), 76-100. 13. Fulginiti, V.A. (2003) Risks of smallpox vaccination. JAMA 290(11), 1452; author reply 1452. 14. Ghobrial, I.M., Witzig, T.E. and Adjei, A.A. (2005) Targeting apoptosis pathways in cancer therapy. CA. Cancer J. Clin. 55(3), 178- 94. 15. Girgis, N.M., Dehaven, B.C., Fan, X., Viner, K.M., Shamim, M. and Isaacs, S.N. (2008) Cell surface expression of the vaccinia virus complement control protein is mediated by interaction with the viral A56 protein and protects infected cells from complement attack. J Virol 82(9), 4205-14. 16. Graham, S.C., Bahar, M.W., Cooray, S., Chen, R.A., Whalen, D.M., Abrescia, N.G., Alderton, D., Owens, R.J., Stuart, D.I., Smith, G.L. and Grimes, J.M. (2008) Vaccinia virus proteins A52 and B14 Share a Bcl-2-like fold but have evolved to inhibit NF-kappaB rather than apoptosis. PLoS Pathog 4(8), e1000128. 17. Green, D.R. and Kroemer, G. (2004) The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science 305(5684), 626-9. 18. Guo, Z.S., Naik, A., O'Malley, M.E., Popovic, P., Demarco, R., Hu, Y., Yin, X., Yang, S., Zeh, H.J., Moss, B., Lotze, M.T. and Bartlett, D.L. (2005) The enhanced tumor selectivity of an oncolytic vaccinia lacking the host range and antiapoptosis genes SPI-1 and SPI-2. Cancer Res 65(21), 9991-8. 19. Harlow, E. and Lane, D. (1988) Immunoblotting. In: E. Harlow and D. Lane (Eds), Antibodies: A Laboratory Manual, pp. 471-510. Cold Spring Harbor New York. 20. Humlova, Z., Vokurka, M., Esteban, M. and Melkova, Z. (2002) Vaccinia virus induces apoptosis of infected macrophages. J. Gen. Virol. 83(Pt 11), 2821-32. 21. Chang, H.Y. and Yang, X. (2000) Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64(4), 821-46. 22. Johnston, J.B. and McFadden, G. (2003) Poxvirus immunomodulatory strategies: current perspectives. J Virol 77(11), 6093-100. 23. Kalbacova, M., Spisakova, M., Liskova, J. and Melkova, Z. (2008) Lytic infection with vaccinia virus activates caspases in a Bcl-2- inhibitable manner. Virus Res 135(1), 53-63. 34 24. Kalbacova, M., Vrbacky, M., Drahota, Z. and Melkova, Z. (2003) Comparison of the effect of mitochondrial inhibitors on mitochondrial membrane potential in two different cell lines using flow cytometry and spectrofluorometry. Cytometry A 52(2), 110-6. 25. Kalbacova, M., Vrbacky, M., Humlova, Z. and Melkova, Z. (2002) Protooncogene Bcl-2 induces apoptosis in several cell lines. Folia Biol. (Praha) 48(1), 15-27. 26. Kaufmann, S.H., Desnoyers, S., Ottaviano, Y., Davidson, N.E. and Poirier, G.G. (1993) Specific proteolytic cleavage of poly(ADP- ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy-induced apoptosis. Cancer Res. 53(17), 3976-85. 27. Kotwal, G.J., Isaacs, S.N., McKenzie, R., Frank, M.M. and Moss, B. (1990) Inhibition of the complement cascade by the major secretory protein of vaccinia virus. Science 250(4982), 827-30. 28. Krecmerova, M., Holy, A., Pohl, R., Masojidkova, M., Andrei, G., Naesens, L., Neyts, J., Balzarini, J., De Clercq, E. and Snoeck, R. (2007) Ester prodrugs of cyclic 1-(S)-[3-hydroxy-2- (phosphonomethoxy)propyl]-5-azacytosine: synthesis and antiviral activity. J Med Chem 50(23), 5765-72. 29. Kumar, S. (2007) Caspase function in programmed cell death. Cell Death Differ 14(1), 32-43. 30. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227(5259), 680-5. 31. Leist, M., Single, B., Castoldi, A.F., Kuhnle, S. and Nicotera, P. (1997) Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J Exp Med 185(8), 1481-6. 32. Locker, J.K. and Griffiths, G. (1999) An unconventional role for cytoplasmic disulfide bonds in vaccinia virus proteins. J. Cell. Biol. 144(2), 267-79. 33. Melkova, Z., Lee, S.B., Rodriguez, D. and Esteban, M. (1997) Bcl-2 prevents nitric oxide-mediated apoptosis and poly(ADP-ribose) polymerase cleavage. FEBS Lett. 403(3), 273-8. 34. Nicotera, P. and Leist, M. (1997) Mitochondrial signals and energy requirement in cell death. Cell Death Differ 4(6), 516. 35. O'Brien, V. (1998) Viruses and apoptosis. J Gen Virol 79 ( Pt 8), 1833-45. 36. Pande, V. and Ramos, M.J. (2003) Nuclear factor kappa B: a potential target for anti-HIV chemotherapy. Curr Med Chem 10(16), 1603-15. 35 37. Pastoret, P.P. and Vanderplasschen, A. (2003) Poxviruses as vaccine vectors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis 26(5-6), 343-55. 38. Rao, R.V., Ellerby, H.M. and Bredesen, D.E. (2004) Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program. Cell Death. Differ. 11(4), 372-80. 39. Safrin, S., Cherrington, J. and Jaffe, H.S. (1997) Clinical uses of cidofovir. Rev Med Virol 7(3), 145-156. 40. Senkevich, T.G., White, C.L., Koonin, E.V. and Moss, B. (2002a) Complete pathway for protein disulfide bond formation encoded by poxviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99(10), 6667-72. 41. Senkevich, T.G., White, C.L., Weisberg, A., Granek, J.A., Wolffe, E.J., Koonin, E.V. and Moss, B. (2002b) Expression of the vaccinia virus A2.5L redox protein is required for virion morphogenesis. Virology 300(2), 296-303. 42. Shisler, J.L., Isaacs, S.N. and Moss, B. (1999) Vaccinia virus serpin-1 deletion mutant exhibits a host range defect characterized by low levels of intermediate and late mRNAs. Virology 262(2), 298-311. 43. Schepis, A., Schramm, B., de Haan, C.A. and Locker, J.K. (2006) Vaccinia virus-induced microtubule-dependent cellular rearrangements. Traffic 7(3), 308-23. 44. Schmidtmayerova, H., Alfano, M., Nuovo, G. and Bukrinsky, M. (1998) Human immunodeficiency virus type 1 T-lymphotropic strains enter macrophages via a CD4- and CXCR4-mediated pathway: replication is restricted at a postentry level. J. Virol. 72(6), 4633-42. 45. Schramm, B. and Locker, J.K. (2005) Cytoplasmic organization of POXvirus DNA replication. Traffic 6(10), 839-46. 46. Sliva, K. and Schnierle, B. (2007) From actually toxic to highly specific--novel drugs against poxviruses. Virol. J. 4, 8. 47. Spisakova, M., Cizek, Z. and Melkova, Z. (2009) Ethacrynic and alpha-lipoic acids inhibit vaccinia virus late gene expression. Antiviral Res 81(2), 156-65. 48. Stewart, T.L., Wasilenko, S.T. and Barry, M. (2005) Vaccinia virus F1L protein is a tail-anchored protein that functions at the mitochondria to inhibit apoptosis. J. Virol. 79(2), 1084-98. 49. Stroh, C. and Schulze-Osthoff, K. (1998) Death by a thousand cuts: an ever increasing list of caspase substrates. Cell Death Differ. 5(12), 997-1000. 36 50. Su, H.P., Lin, D.Y. and Garboczi, D.N. (2006) The structure of G4, the poxvirus disulfide oxidoreductase essential for virus maturation and infectivity. J Virol 80(15), 7706-13. 51. Taylor, J.M. and Barry, M. (2006) Near death experiences: poxvirus regulation of apoptotic death. Virology 344(1), 139-50. 52. Taylor, J.M., Quilty, D., Banadyga, L. and Barry, M. (2006) The vaccinia virus protein F1L interacts with Bim and inhibits activation of the pro-apoptotic protein Bax. J. Biol. Chem. 281(51), 39728-39. 53. Vrbacky, M., Krijt, J., Drahota, Z. and Melkova, Z. (2003) Inhibitory effects of Bcl-2 on mitochondrial respiration. Physiol. Res. 52(5), 545-54. 54. Wasilenko, S.T., Stewart, T.L., Meyers, A.F. and Barry, M. (2003) Vaccinia virus encodes a previously uncharacterized mitochondrial- associated inhibitor of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100(24), 14345-50. 55. WHO. (1980) Wkly. Epidem. Rep. - Releve Epidem. Hebd. WHO. 55. May 16, 1980. 8. Publications Spisakova, M., Cizek, Z. a Melkova, Z. (2009) Ethacrynic and alpha-lipoic acids inhibit vaccinia virus late gene expression. Antiviral Res 81(2), 156-65. IF: 3.613 * Kalbacova, M., Spisakova, M., Liskova, J.,Melkova, Z., 2008. Lytic infection with vaccinia virus activates caspases in a Bcl-2-inhibitable manner. Virus Res. 135, 53-63. IF: 2.429 * Martina Spišáková, Marie Kalbáčová, Jana Lišková and Zora Mělková: Caspase activation during lytic infection by Vaccinia virus. New frontiers in the research of PhD students: Conference of Medical Schools in the Czech and 37 Slovak Republics: Hradec Králové, December 8-9.2005, p.73-76. 38
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Martina Spišáková, Ph.D. 1.81 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Martina Spišáková, Ph.D. 2.5 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Martina Spišáková, Ph.D. 411 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Martina Spišáková, Ph.D. 377 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Jitka Forstová, CSc. 80 kB