velikost textu

Regulace aktivity a aktivace kathepsinu D

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Regulace aktivity a aktivace kathepsinu D
Název v angličtině:
Regulation of Cathepsin D Activity and Activation
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Martin Máša, Ph.D.
Id práce:
98090
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (N1406)
Obor studia:
Biochemie (NBIOD)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
19. 4. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Disertační práce SOUHRN REGULACE AKTIVITY A AKTIVACE KATHEPSINU D Martin Máša školitel: Michael Mareš Katedra biochemie Ústav organické chemie a biochemie Přírodovědecká fakulta Akademie věd Univerzity Karlovy České republiky PRAHA 2009 Úvod Kathepsin D (KD) je lysozomální aspartátová peptidasa přítomna ve všech savčích organizmech, její hlavní funkcí je katabolická degradace proteinů. Dále je zapojen v řadě fyziologických procesů jako jsou apoptóza a tkáňová homeostáze, podílí se na regulaci angiogeneze a na tvorbě peptidových antigenů. Z hlediska patofyziologie je KD studován ve spojitosti s několika chorobami jako jsou Alzheimerova choroba a rakovina. Alzheimerova choroba je neurodegenerativní onemocnění mozku obecně považované za nejběžnější příčinu senilní demence. V průběhu nemoci dochází k ukládání plaků β-amyloidních peptidů (β-AP) na povrch neuronů, což vede postupně k jejich atrofii a rozpadu. β-AP vznikají proteolytickým štěpením amyloidního prekurzorového proteinu (APP) nejčastěji tzv. sekretasami1. U pacientů s Alzheimerovou chorobou byly nalezeny vysoké koncentrace KD v mozkomíšním moku2. Bylo ukázáno, že KD je schopen štěpit APP za vzniku patogenního β-AP a přispívat tak k rozvoji Alzheimerovy choroby3. U pacientů s Alzheimerovou chorobou byl v genu KD nalezen minoritní polymorfizmus, který má za následek záměnu jedné aminokyseliny v aktivačním peptidu zymogenu KD. Některé studie spojují tuto variabilitu s vyšším rizikem rozvoje Alzheimerovy choroby v některých populacích, nicméně biochemická role této substituce není dosud známa4. Zymogen KD, nazývaný prokathepsin D (proKD), je ve zvýšené míře exprimován a sekretován rakovinnými buňkami, jeho zvýšená koncentrace v nádorech koreluje se vyšším množstvím metastáz5. Role proKD při vzniku a rozvoji nádorového onemocnění je vysvětlována několika mechanizmy působení. Bylo zjištěno, že proKD má mitogenní aktivitu, která nesouvisí s proteolytickou funkcí a je zprostředkována interakcí s neznámým povrchovým receptorem buněk. Některé studie předpokládají, že se této vazby účastní 6. aktivační peptid proKD Dalším mechanizmem je proteolytické působení aktivovaných forem proKD, které mohou degradovat extracelulární matrix, aktivovat růstové faktory nebo zabraňovat sekreci růstových inhibitorů7. Otázkou zůstává jestli může být sekretovaný proKD aktivován a působit proteolyticky v extracelulárním prostředí. ProKD je v klinické praxi používán jako nezávislý prognostický faktor při léčbě rakoviny, protože jeho vzrůstající hladiny v séru pacientů indikující relaps onemocnění8. Uvažuje se také o použití imunizace pomocí proKD v prevenci vzniku rakoviny9. Bylo prokázáno, že protilátky proti proKD jsou schopny potlačit růst nádoru9. 1 Cíle Tato práce se zabývá lidským KD. Biochemickými metodami zkoumá aktivaci jeho zymogenu (proKD) a faktory regulující tento proces. Stanovuje si následující dílčí cíle: Vypracovat postup izolace a) KD ze savčích tkání, b) proKD produkovaného transgenní lidskou buněčnou kulturou. Analyzovat strukturně-funkční vztahy v aktivačním peptidu (propeptidu) proKD a mapovat jeho interakční oblasti s jádrem enzymu. Určit faktory regulující aktivaci proKD jako jsou pH prostředí, interakce se sulfatovanými polysacharidy a jinými peptidasami. 2 Výsledky Příprava kathepsinu D a jeho proenzymu Byl vypracován efektivní izolační postup pro získání zralého KD z placent, které představují v současné době nejlépe dostupnou lidskou tkáň. Dále byla vyvinuta izolační procedura proKD sekretovaného transgenními lidskými buňkami do média. Postup využívá imunoafinitní chromatografii za neutrálního pH, která umožňuje získání proenzymu nekontaminovaného autoaktivačním intermediátem. Modulace aktivity kathepsinu D pomocí sulfatovaných polysacharidů Je známo, že některé sulfatované polysacharidy (SPs) mohou modulovat aktivitu a stabilitu cysteinových kathepsinů10. Působení SPs na aspartátové kathepsiny nicméně nebylo dosud detailně studováno. Výsledky této práce ukazují, že SPs, jako jsou dextran sulfát, chondroitin sulfát a heparin, zvyšují několikanásobně proteolytickou aktivitu KD měřenou s peptidovým i proteinovým substrátem. Tento efekt závisí na typu SPs, jejich koncentraci a pH prostředí. Působení SPs má iontový charakter a zřejmě ovlivňuje vazbu substrátu do aktivního místa KD, jak ukazuje významné snížení hodnoty Km. Samotný KD je aktivní v kyselém pH jaké je v prostředí lysozomů, v přítomnosti heparinu se aktivitní oblast KD rozšiřuje směrem do neutrální oblasti. Heparinu podobné glykosaminoglykany jsou přítomny na povrchu buněk a v extracelulárním matrix, kde regulují řadu buněčných procesů11. Lze očekávat, že jejich přítomnost umožňuje KD být v tomto prostředí proteolyticky aktivní. Strukturně funkční analýza propeptidu v prokathepsinu D Propeptid (aktivační peptid) se nachází na N-konci molekuly proKD, blokuje aktivní místo enzymu a funguje tak jako intramolekulární inhibitor. Dosud není známa struktura proKD, ani nebyly detailně analyzovány strukturní a funkční vlastnosti propeptidu proKD. Byl konstruován prostorový model proKD, který sloužil k navržení syntetických peptidů odvozených ze struktury propeptidu a přilehlé části zralého KD. Analýzou jejich inhibice se zralým KD byly určeny tři strukturní domény propeptidu interagující s jádrem enzymu: N-konec propeptidu, okolí “Lys-Tyr kotvy“ v blízkosti aktivního místa a N-konec zralého KD (Obrázek 1). 3 1) N-konec propeptidu funguje jako nanomolární inhibitor, interaguje s enzymem mimo aktivní místo převážně iontovými interakcemi, které jsou oslabovány v kyselém pH nebo účinkem SPs. 2) Druhá inhibiční doména (''Lys-Tyr kotva'') identifikovaná v propeptidu, obsahuje aminokyseliny Lys34p a Tyr35p (Obrázek 1), které jsou stěžejní pro interakci celé oblasti s aktivním místem enzymu. Inhibice této domény je řádově mikromolární a s klesajícím pH se rychle oslabuje. Je známé, že v této oblasti byl na genové úrovni nalezen polymorfizmus (majoritní Ala38p, minoritní Val38p) spojovaný se zvýšeným rizikem rozvoje Alzheimerovy choroby4. Analýza této substituce nyní ukázala, že lokální strukturní změny v blízkosti aminokyselin Lys34p a Tyr35p mohou kriticky ovlivňovat interakční podmínky této propeptidové domény a substituce Ala38p valinem může oslabovat interakci propeptidu a usnadňovat aktivaci proKD. 3) N-konec zralého KD funguje jako autoregulační doména. V kyselém pH se tento úsek nachází mimo aktivní místo, přechodem do neutrálního prostředí se relokalizuje a blokuje aktivní místo enzymu. Obrázek 1. Schéma identifikovaných inhibičních domén v propeptidu a N-konci zralého kathepsinu D (KD). Sekvence propeptidu je značena modře (1p-44p), sekvence N-konce zralého KD zeleně (1- 10). Inhibiční domény jsou vyznačeny červenými obdélníky. Dále jsou znázorněny aminokyseliny Lys34p a Tyr35p (#) propeptidu interagující s katalytickými aspartáty a zbytek Ala38p (%) nalezený na genové úrovni jako polymorfně variabilní. Vyznačeny jsou i pozice štěpených vazeb během autoaktivace proKD a asistované aktivace pomocí kathepsinu L. Přípona ''p'' označuje číslování propeptidu. Aktivace prokathepsinu D Tato práce přináší první detailní biochemickou studii dvou mechanizmů aktivace proKD: autoaktivačního a zprostředkovaného kathepsinem L. K autoaktivaci proKD dochází v kyselém pH, vzniká tak proteolyticky aktivní intermediát pseudoKD (Obrázek 1). Autoaktivace proKD je urychlována v přítomností SPs. 4 Heparin umožňuje i posun autoaktivační oblasti proKD směrem do neutrálního prostředí. Je tedy možné, že rakovinnými buňkami sekretovaný proKD se v extracelulárním prostředí aktivuje a interakce molekul proKD/KD se SPs tak představuje mechanizmus, který podporuje proteolytickou degradaci extracelulárního matrix a rozvoj metastáz. Kompletní proces aktivace proKD a vznik zralého KD nebyl dosud plně objasněn. Výsledky této studie umožnily doplnit předpokládané aktivační schéma proKD (Obrázek 2). Kathepsin L je schopen proteolyticky aktivovat proKD, místo štěpené vazby se nachází v C-koncové části propeptidu proKD (Obrázek 1). Vzniklý produkt byl nazván pseudo(L1)KD, jedná se o nový potenciální aktivační intermediát proKD, který je proteolyticky aktivní. K této asistované aktivaci dochází v neutrálním prostředí, mimo pH oblast autoaktivace proKD. Obrázek 2. Předpokládané schéma aktivace prokathepsinu D (proKD) na kathepsin D (KD). Šipky vyznačují průběh proteolytické konverze, u nich je uvedena peptidasa účastnící se daného procesu, ''auto'' znamená monomolekulární autoaktivaci proKD, ''?'' znázorňuje dosud neidentifikované endo- nebo aminopeptidasy zapojené do vzniku zralého KD. Závěr V této práci byly popsány biochemické regulační mechanizmy účastnící se aktivace proKD, jehož konverze na KD je důležitým faktorem v řadě fyziologických a patofyziologických procesů. Bylo ukázáno, že SPs modulují aktivitu KD i aktivaci proKD. Byl identifikován nový potenciální aktivační intermediát pseudo(L1)KD zapojený v dosud neobjasněném procesu vzniku zralého KD. Výsledky analýzy mapování inhibičních domén ve struktuře propeptidu proKD lze využít při konstrukci nových typů inhibitorů KD a dalších medicinálně významných aspartátových peptidas. 5 Citace 1. Selkoe DJ: Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev 2001, 81(2): 741-766. 2. Schwagerl AL, Mohan PS, Cataldo AM, Vonsattel JP, Kowall NW, Nixon RA: Elevated levels of the endosomal-lysosomal proteinase cathepsin D in cerebrospinal fluid in Alzheimer disease. J Neurochem 1995, 64(1): 443-446. 3. Sadik G, Kaji H, Takeda K, Yamagata F, Kameoka Y, Hashimoto K, Miyanaga K, Shinoda T: In vitro processing of amyloid precursor protein by cathepsin D. Int J Biochem Cell Biol 1999, 31(11): 1327-1337. 4. Papassotiropoulos A, Bagli M, Kurz A, Kornhuber J, Förstl H, Maier W, Pauls J, Lautenschlager N, Heun R: A genetic variation of cathepsin D is a major risk factor for Alzheimer's disease. Ann Neurol 2000, 47(3): 399-403. 5. Vignon F, Capony F, Chambon M, Freiss G, Garcia M, Rochefort H: Autocrine growth stimulation of the MCF 7 breast cancer cells by the estrogen-regulated 52 K protein. Endocrinology 1986, 118(4): 1537-1545. 6. Vetvicka V, Vetvickova J, Hilgert I, Voburka Z, Fusek M: Analysis of the interaction of procathepsin D activation peptide with breast cancer cells. Int J Cancer 1997, 73: 403-409. 7. Briozzo P, Morisset M, Capony F, Rougeot C, Rochefort H: In vitro degradation of extracellular matrix with Mr 52,000 cathepsin D secreted by breast cancer cells. Cancer Res 1988, 48(13): 3688-3692. 8. Spyratos F, Maudelonde T, Brouillet JP, Brunet M, Defrenne A, Andrieu C, Hacene K, Desplaces A, Rouëssé J, Rochefort H: Cathepsin D: an independent prognostic factor for metastasis of breast cancer. Lancet 1989, 2(8672): 1115-1118. 9. Vetvicka V, Vetvickova J, Fusek M: Anti-human procathepsin D activation peptide antibodies inhibit breast cancer development. Breast Cancer Res Treat 1999, 57(3): 261-269. 10. Rozman J, Stojan J, Kuhelj R, Turk V, Turk B: Autocatalytic processing of recombinant human procathepsin B is a bimolecular process. FEBS Lett 1999, 459(3): 358-362. 11. Tersariol IL, Pimenta DC, Chagas JR, Almeida PC: Proteinase activity regulation by glycosaminoglycans. Braz J Med Biol Res 2002, 35(2): 135-144. 6
Abstract v angličtině:
PhD Thesis ABSTRACT REGULATION OF CATHEPSIN D ACTIVITY AND ACTIVATION Martin Máša supervisor: Michael Mareš Department of Biochemistry Institute of Organic Chemistry and Faculty of Science Biochemistry Charles University Academy of Sciences of the Czech Republic PRAGUE 2009 Introduction Cathepsin D (CD) is an aspartic peptidase located in the lysosomes of all mammalian cells, its main role is catabolic degradation of proteins. More over CD is known to participate in a range of physiological processes such as apoptosis and tissue homeostasis, as well as in the regulation of angiogenesis and the production of peptidic antigens. The role of CD in pathophysiology is associated with several diseases such as Alzheimer's disease and cancer. Alzheimer's disease is a neurodegenerative disorder, which is generally considered to be the most common form of dementia. Progression of this disease is accompanied with the deposition of amyloid plaques (AP) in the brain, which leads to neurodegeneration. The AP is a fragment released from amyloid precursor protein (APP) cleaved by secretases1. High levels of CD were found in cerebrospinal fluid of the Alzheimer's patients2. It was demonstrated that CD is able to cleave APP and produce the pathogenic AP. A genetic polymorphism in the CD gene was reported, which changes single amino acid in the propeptide of CD zymogen. Some studies have shown that this variation is a major risk factor for the development of Alzheimer’s disease in some families or populations, however biochemical function of this substitution is unknown4. Procathepsin D (proCD), zymogen of CD, is overexpressed and hypersecreted by cancer cells where its concentration is correlated with increased metastatic potential5. Different mechanisms have been proposed as to be responsible for the mitogenicity of proCD. Some studies indicate its action as a ligand involved in interaction with unknown cell surface 6. receptor. This interaction seems to be mediated by activation peptide of proCD On the other hand, activated forms of proCD has been implicated in degradation of extracellular matrix, activating growth factors or preventing secretion of growth inhibitors7. The question remains as to whether secreted proCD could be activated extracellularly and proteolytically active in a sufficiently acidic environment7. ProCD is used as an independent prognostic factor in clinical oncology, its increasing level in serum of patients indicates poor survival or relapse of the cancer8. It was suggested that immunization by proCD can prevent development of cancer, because antibodies against proCD can help to control cancer cells growth9. 1 Aims of the thesis This thesis is focused on human CD. Activation of proCD zymogen to CD and factors involved in regulation of this process were investigated by biochemical methods. The partial aims of this study are: Develop isolation procedure to obtain purified a) CD from mammalian tissues and b) proCD produced by transgenic human cell line. Analyze structure-function relationships in the activation peptide (propeptide) of proCD and to map interaction domains with the enzyme core. Determine factors like pH, sulphated polysaccharides and other processing peptidases involved in the regulation of proCD activation. 2 Results Preparation of cathepsin D and its zymogen The new effective isolation procedure of mature CD was developed. The protein was purified from human placenta which is nowadays the most available human organ. The new purification procedure of proCD secreted by transgenic cells to medium was designed. The purification protocol utilizes an immunoaffinity chromatography at neutral pH. These conditions allow to obtain pure zymogen free of contamination by the autoactivation intermediate. Modulation of cathepsin D activity by sulphated polysaccharides It was reported previously that some sulphated polysaccharides (SPs) might modulate activity and stability of cysteine cathepsins10. So far the action of SPs on aspartic cathepsins was not yet investigated. Results of this thesis show that SPs such as dextran sulphate, chondroitin sulphate and heparin, enhance proteolytic activity measured with peptidic and as well as protein substrates. This effect is dependent of pH, concentration and type of SPs. These macromolecules affect binding of substrate into the active site of CD which is demonstrated by significant decrease of Km value for a substrate. CD is proteolytically active at acidic pH, in the presence of heparin the activity range extends towards the neutral pH conditions. Heparin- like glycosaminoglycans are presented on the cell surface and the extracellular matrix where are involved in a variety of biological functions11. This indicates that the presence of glycosaminoglycans might facilitate proteolytic action of CD in the extracellular milieu. Structure-function analysis of procathepsin D propeptide The propeptide (activation peptide) is located at the N-terminus of the proCD molecule, it blocks the entire active site and hence inhibits the enzyme activity. The structure of proCD has not yet been determined and neither was the mechanism of the propeptide action or its structure-function relationships. A spatial model of proCD was constructed as a tool for structure-based design of peptidic fragments derived from its propeptide and adjacent N-terminus of the mature CD. The inhibitory potency of synthetic propeptide fragments was evaluated using the kinetic 3 assay with the mature CD. These mapping indicates three structure domains interacting with the enzyme core: N-terminus of the propeptide, ''Lys-Tyr anchor'' at the active site, and N-terminus of the mature CD (Figure 1). 1) The N-terminus of the propeptide displays nanomolar inhibition, it interacts with enzyme core outside of the active site mainly through electrostatic interactions, which are sensitive to decreasing pH or presence of SPs. 2) Second inhibition domain (''Lys-Tyr anchor'') identified in the propeptide contains amino acids Lys34p-Tyr35p that interact through hydrogen bonds with catalytic aspartates. Inhibition of this domain is in the micromolar range and is weakened with decreasing pH. A genetic polymorphism in this segment was reported (major Ala38p, minor Val38p); it is assumed that this substitution is a major risk factor for the development of Alzheimer’s disease in some families or populations4. Analysis of this position performed in this thesis indicates, that alanine in position 38p is necessary for effective interaction of entire domain with the enzyme core. It suggests that substitution of Ala38p by valine might modulate the activation of proCD. 3) N-terminus of mature CD serves as autoregulatory domain. At low pH, this segment is situated outside of the active site. At neutral pH, the mature N-terminus is repositioned into the active site and blocks access of the substrate. Figure 1. Positions of inhibitory domains identified in the propeptide and N-terminus of mature cathepsin D (CD). Sequence of the propeptide is in blue (1p-44p), sequence of the N-terminus of the mature CD is in green (1-10). Inhibitory domains are highlighted in red boxes. Amino acids Lys34p and Tyr35p (#) of the propeptide interacts with catalytic aspartates. Substitution of Ala38p (%) to valine was reported to be associated with pathology. Green arrows point at bonds cleaved during autoactivation of proCD and activation assisted by cathepsin L. The suffix ''p'' indicates propeptide numbering. Activation of procathepsin D This thesis presents the first detailed biochemical study of two mechanisms of proCD activation, namely autoactivation and assisted activation by cathepsin L. 4 The autoactivation takes place at acid pH and is associated with the removal of the N-terminus of the propeptide, which results in the formation of proteolytically active form called pseudoCD (Figure 2). The autoactivation process is accelerated in the presence of SPs. Moreover, the pH profile of proCD autoactivation is modulated by heparin that facilitates the autoactivation processing at close to neutral pH. In this way, the proCD secreted by cancer cells might be activated in the extracellular environment that is rich in heparin-like glycosaminoglycans. Such a glycosaminoglycans-mediated modulation of activation and activity of proCD/CD molecules can play an important role in the cancerogenesis process. The results of this study suggest that the proCD activation represents a complex multi-pathway process (Figure 2). It was demonstrated that cathepsin L is able to proteolytically process proCD by cleaving its propeptide at the C-terminus (Figure 1). The product of this assisted activation termed pseudo(L1)CD is a new activation intermediate of proCD (Figure 2). This activation pathway takes place at neutral pH where the autoactivation does not occur. Figure 2. Scheme of activation of procathepsin D (proCD) to mature cathepsin D (CD). Arrows represent events of proteolytic conversion; peptidases involved in this processing are indicated; ''auto'' means monomolecular autoactivation of proCD; ''?'' means unknown endo- or aminopeptidases involved in the generation of mature CD. Conclusion In this work, biochemical mechanisms regulating the process of proCD activation were described. They are potentially involved in the conversion of proCD to mature CD, which represents an important event in a number of physiological and pathophysiological processes. It was demonstrated that SPs modulate the activity of mature CD and the activation of proCD, and a new activation intermediate pseudo(L1)CD was characterized. The structure- function mapping of the proCD propeptide identified inhibitory domains that can be used in the construction of inhibitors of CD and other medically important aspartic peptidases. 5 References 1. Selkoe DJ: Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev 2001, 81(2): 741-766. 2. Schwagerl AL, Mohan PS, Cataldo AM, Vonsattel JP, Kowall NW, Nixon RA: Elevated levels of the endosomal-lysosomal proteinase cathepsin D in cerebrospinal fluid in Alzheimer disease. J Neurochem 1995, 64(1): 443-446. 3. Sadik G, Kaji H, Takeda K, Yamagata F, Kameoka Y, Hashimoto K, Miyanaga K, Shinoda T: In vitro processing of amyloid precursor protein by cathepsin D. Int J Biochem Cell Biol 1999, 31(11): 1327-1337. 4. Papassotiropoulos A, Bagli M, Kurz A, Kornhuber J, Förstl H, Maier W, Pauls J, Lautenschlager N, Heun R: A genetic variation of cathepsin D is a major risk factor for Alzheimer's disease. Ann Neurol 2000, 47(3): 399-403. 5. Vignon F, Capony F, Chambon M, Freiss G, Garcia M, Rochefort H: Autocrine growth stimulation of the MCF 7 breast cancer cells by the estrogen-regulated 52 K protein. Endocrinology 1986, 118(4): 1537-1545. 6. Vetvicka V, Vetvickova J, Hilgert I, Voburka Z, Fusek M: Analysis of the interaction of procathepsin D activation peptide with breast cancer cells. Int J Cancer 1997, 73: 403-409. 7. Briozzo P, Morisset M, Capony F, Rougeot C, Rochefort H: In vitro degradation of extracellular matrix with Mr 52,000 cathepsin D secreted by breast cancer cells. Cancer Res 1988, 48(13): 3688-3692. 8. Spyratos F, Maudelonde T, Brouillet JP, Brunet M, Defrenne A, Andrieu C, Hacene K, Desplaces A, Rouëssé J, Rochefort H: Cathepsin D: an independent prognostic factor for metastasis of breast cancer. Lancet 1989, 2(8672): 1115-1118. 9. Vetvicka V, Vetvickova J, Fusek M: Anti-human procathepsin D activation peptide antibodies inhibit breast cancer development. Breast Cancer Res Treat 1999, 57(3): 261-269.1. 10. Rozman J, Stojan J, Kuhelj R, Turk V, Turk B: Autocatalytic processing of recombinant human procathepsin B is a bimolecular process. FEBS Lett 1999, 459(3): 358-362. 11. Tersariol IL, Pimenta DC, Chagas JR, Almeida PC: Proteinase activity regulation by glycosaminoglycans. Braz J Med Biol Res 2002, 35(2): 135-144. 6
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Martin Máša, Ph.D. 18.62 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Martin Máša, Ph.D. 498 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Martin Máša, Ph.D. 500 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Marie Tichá, CSc. 80 kB