velikost textu

Separace žaludečních aspartátových proteas pomocí afinitní chromatografie

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Separace žaludečních aspartátových proteas pomocí afinitní chromatografie
Název v angličtině:
The Separation of Gastric Aspartic Proteases Using Affinity Chromatography
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Jana Frýdlová, Ph.D.
Id práce:
98052
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra analytické chemie (31-230)
Program studia:
Chemie (N1407)
Obor studia:
Analytická chemie (NANALD)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
31. 3. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Abstrakt Lidská žaludeční šťáva obsahuje zejména aspartátové proteasy - pepsin A a pepsin C. Oba pepsiny jsou produkovány v žaludeční sliznici jako inaktivní pepsinogeny (pepsinogen A a pepsinogen C), které se liší svými fyzikálně-chemickými a imunologickými vlastnostmi. Oba pepsinogeny obsahují několik izozymogenů. K aktivaci pepsinogenů na příslušné pepsiny dochází v kyselém prostředí žaludku. Hladiny pepsinogenů v krevním séru odrážejí morfologický a funkční stav žaludeční sliznice. Již mnoho let je pozorována souvislost mezi hladinami lidských pepsinogenů a některými žaludečními onemocněními (např. rakovinou žaludku, gastritidou). Z diagnostického hlediska je významný především vzájemný poměr pepsinogenu A a pepsinogenu C nejen v žaludeční sliznici, ale také v krevním séru. Pacienti s rakovinou žaludku nebo s atrofickou gastritidou mají významně snížený poměr pepsinogenu A a pepsinogenu C v krevním séru oproti zdravým jedincům. Během žaludečních onemocnění dochází také ke změnám zastoupení jednotlivých izozymogenů. Určení těchto změn by proto mohlo být významné pro včasnou diagnostiku zmíněných onemocnění. Téma dizertační práce je součástí projektu zabývajícího se zejména vypracováním metody pro separaci žaludečních aspartátových proteas, která by byla vhodná pro sledování jejich změn během zmíněných onemocnění. Dizertační práce se konkrétně zabývala přípravou vhodných afinitních sorbentů pro separaci pepsinů a pepsinogenů. Při výběru vhodného afinitního ligandu pro tyto proteasy jsme vycházeli ze známého substrátu N-acetyl-L- fenylalanyl-3,5-dijod-L-tyrosinu, pomocí kterého lze stanovit aktivitu pepsinu A ve směsi s pepsinem C. Byly připraveny tři afinitní sorbenty: jodovaná L-tyrosin-Sepharosa, 3,5-dijod- L-tyrosin-Sepharosa a N-acetyl-L-fenylalanin-Sepharosa. Připravené sorbenty byly charakterizovány pomocí modelového enzymu (prasečího pepsinu A). Při studiu interakce prasečího pepsinu A a jeho komplexu s pepstatinem A s připravenými sorbenty bylo prokázáno, že se aktivní místo enzymu nepodílí na jeho interakci s těmito sorbenty. Dále byla prokázána účast fosfátové skupiny v molekule pepsinu na jeho interakci s N-acetyl-L- fenylalanin-Sepharosou. Všechny připravené sorbenty byly použity k separaci pepsinu A a pepsinu C z okyseleného homogenátu lidské žaludeční sliznice pacientů s různými žaludečními chorobami, případně žaludeční šťávy zdravého jedince. Výsledky ukázaly, že nejvhodnějším sorbentem pro separaci pepsinů je N-acetyl-L-fenylalanin-Sepharosa. Pomocí tohoto sorbentu se také podařilo částečně separovat jeden z izozymogenů pepsinogenu A z lidské žaludeční sliznice.
Abstract v angličtině:
Abstract Human gastric juice contains mainly aspartic proteases - pepsin A and pepsin C. Both pepsins are produced by gastric mucosa as inactive pepsinogens (pepsinogen A and pepsinogen C) that differ in their physico-chemical and immunological properties. Both pepsinogens consist of molecular variants, isozymogens. Pepsinogens are activated to the corresponding pepsins in the acidic environment of the gastric lumen. The levels of pepsinogens in serum reflect the morphological and functional status of gastric mucosa. The levels of pepsinogens are associated with gastric diseases (e.g. gastric cancer, gastritis). For a diagnostic purpose, the ratio of pepsinogen A to pepsinogen C not only in the gastric mucosa but also in serum is relevant. The gastric cancer patients or the atrophic gastritis patients have significantly lower ratio of serum pepsinogen A to pepsinogen C in comparison with the healthy subjects. In addition, proportion of individual isozymogens reflects the type of the gastric disease. Determination of changes in pepsinogen levels could be useful for early diagnostics of gastric diseases mentioned above. A subject of this Ph.D. thesis is a part of a long-term investigation that focuses on the elaboration of methods for the separation of gastric aspartic proteases that would be suitable for monitoring of their changes in mentioned diseases. This thesis was mainly focused on preparation of affinity sorbents suitable for separation of pepsins and pepsinogens. The choice of ligands was based on the substrate N-acetyl-L-phenylalanyl-3,5-diiodo-L-tyrosine that is used to differentiate pepsin A and pepsin C. The following three affinity sorbents were prepared: iodinated L-tyrosine-Sepharose, 3,5-diiodo-L-tyrosine-Sepharose, and N-acetyl-L- phenylalanine-Sepharose. The basic characteristics of the prepared affinity sorbents were determined using the model enzyme (porcine pepsin A). The comparison of the chromatographic behavior of porcine pepsin A and its complex with pepstatine A showed that the enzyme active site was not involved in the enzyme interaction with ligands. In addition, participation of a phosphate group of the pepsin molecule was proved in the interaction of porcine pepsin A with N-acetyl-L-phenylalanine-Sepharose. All prepared sorbents were used for the separation of human pepsin A and pepsin C from acidified extract of gastric mucosa of patients with various types of diseases, eventually from gastric juice of healthy subjects. Out of the prepared sorbents, N-acetyl-L-phenylalanine-Sepharose was found to be the most suitable for this purpose. In addition, one of the isozymogens of pepsinogen A from gastric human mucosa was partially separated using this sorbent.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Jana Frýdlová, Ph.D. 850 kB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Jana Frýdlová, Ph.D. 55 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Jana Frýdlová, Ph.D. 9 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 80 kB