velikost textu

Analytické hodnocení biologicky aktivních látek chromatografickými metodami

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Analytické hodnocení biologicky aktivních látek chromatografickými metodami
Název v angličtině:
Analytical Evaluation of Biologically Active Substances by Chromatographic Methods
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Ivana Pasáková, Ph.D.
Školitel:
Doc. RNDr. Jaroslav Sochor, CSc.
Oponenti:
Doc. PharmDr. Milan Nobilis, CSc.
prof. Ing. Michal Holčapek, Ph.D.
Id práce:
97730
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy (16-16190)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Farmaceutická analýza (DFA)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
22. 9. 2009
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Předkládaná disertační práce se zabývá vývojem a validací chromatografických metod vhodných pro hodnocení vybraných biologicky aktivních látek. Vzhledem k dominantnímu postavení metody HPLC ve farmaceutické analýze, byla pro hodnocení analytů zvolena právě tato metoda ve spojení s UV a MS detekcí. Teoretická část je zaměřena na použité chromatografické metody a problematiku řešenou v rámci experimentální práce. Nejprve je uveden stručný přehled všech chromatografických metod a následně je detailněji popsána nejběžnější analytická metoda HPLC. Poté je věnována pozornost hmotnostní spektrometrii, která se v posledních letech stala nepostradatelnou metodou nejen ve farmaceutické analýze. To především díky její vysoké citlivosti a možnosti získat strukturní informace o analytech. Kromě teoretického úvodu a popisu MS instrumentace je pozornost věnována také jejím aplikacím i novým trendům. Další kapitoly se věnují problematice transdermálního podání léčiv, specifikům antiretrovirální terapie a především hodnoceným analytům. Experimentální část je zpracována jako komentovaný soubor publikovaných prací a je rozdělena do dvou tematických celků. První celek tvoří tři práce zaměřené na analytické hodnocení nového akcelerantu transdermální penetrace - transkarbamu 12. Druhý celek je tvořen prací zabývající se analytickým hodnocením antiretrovirotika efavirenz v biologickém materiálu. První tematický celek se zabývá vývojem a validací vhodných chromatografických metod pro analytické hodnocení T 12. Tento nový akcelerant transdermální penetrace se začal na FaF UK vyvíjet v 90. letech, a v roce 2001 byl patentován. Hlavním podnětem, jenž tento výzkum inicioval, bylo omezené množství v klinické praxi užívaných transdermálních akcelerantů. V podstatě jediným, široce používaným a účinným akcelerantem, je od roku 1976 Azon®. Zavedení nového, vysoce účinného, akcelerantu tak představuje možnost rozšíření aplikací pro transdermální podání léčiv, které je výhodnou alternativou oproti ostatním, běžně užívaným, formám podání léčiv. Vzhledem k absenci jakékoli analytické metody pro hodnocení T 12, bylo pro jeho zavedení do farmaceutické praxe nezbytné vyvinout a zvalidovat chromatografické metody, které by umožnily hodnocení čistoty a stability této látky. V pilotní studii byla jako první vyvinuta rychlá, jednoduchá a finančně nenáročná metoda TLC, která umožnila separovat T 12 od jeho dvou hydrolytických rozkladných produktů 6-aminohexanové kyseliny (AH) a dodekanolu (D). Vzhledem k absenci chromoforu ve struktuře T 12, i jeho degradačních produktů AH a D, musela být před vlastní analýzou vždy provedena derivatizace pomocí Disertační práce Souhrn benzoyl chloridu. V rámci pilotní studie byla vyvinuta také metoda HPLC/UV, která umožnila separaci T 12 od derivatizačního činidla resp. vedlejších produktů derivatizace. Další experimentální práce byla zaměřena na vývoj nové HPLC/UV metody, která umožnila hodnocení T 12 i rozkladných produktů AH a D. Protože dříve vyvinutý postup derivatizace neumožnil dosáhnout dostatečné citlivosti analýzy, bylo vybráno nové derivatizační činidlo (3,5-dinitrobenzoyl chlorid). Celý postup derivatizace byl proto následně optimalizován. Nicméně bylo zřejmé, že pro rutinní využití metody v průmyslové výrobě není časově náročná derivatizace vhodná. Proto byla hledána alternativa, která by umožnila tento krok eliminovat. Takovou alternativu představuje detekce za využití hmotnostní spektrometrie, která umožňuje hodnocení látek na základě jejich poměru m/z a nevyžaduje tedy přítomnost chromoforu v molekule analytu. Byla vyvinuta a validována metoda HPLC/MS, která umožnila hodnocení čistoty a stability substance T 12. Hodnocenými nečistotami byly: AH - hydrolytický rozkladný produkt, CA - vstupní surovina pro syntézu T 12 a nečistota DAH - vedlejší produkt syntézy. DAH byla objevena a identifikována právě díky využití MS detekce při analýze vzorků. Vyvinutá metoda HPLC/MS je v současnosti využívána pro hodnocení čistoty a stability substance T 12 v průmyslové výrobě. Vzhledem k nutnosti rychlého zavedení této metody do praxe, byl její vývoj časově omezený, a proto nemohlo dojít ke zcela ideálnímu zoptimalizování všech parametrů analýzy. Určitou slabinu tak představuje časová náročnost a gradientový profil analýzy. Další vývoj byl proto zaměřen právě tímto směrem a v současné době je připravována publikace, která se zabývá vývojem a validací nové, isokratické metody HPLC/MS s celkovou dobou analýzy 12 minut. Druhý tematický celek se věnuje analytickému hodnocení EFV v biologickém materiálu. Práce byla vypracována na Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg v Německu, kde byla tato problematika řešena v rámci rozsáhlé klinické studie. EFV byl doporučen WHO k léčbě HIV infekce v afrických zemích. Stejně jako většina ostatních antiretrovirotik, je i EFV charakteristický velkou inter-individuální variabilitou plasmatických koncentrací. Z tohoto důvodu patří antiretrovirotika do skupiny léčiv, která by měla být u pacientů monitorována a podávané dávky individuálně upraveny. Hlavní část biotransformace EFV probíhá pomocí CYP-450. V případě koinfekce HIV a TBC je léčivem volby pro TBC rifampicin, induktor CYP-450, který může výrazným způsobem snižovat plasmatické koncentrace EFV. První část projektu byla zaměřena na vývoj a validaci vhodných chromatografických metod, které by umožnily analytické hodnocení EFV v plasmě, jeho volné frakce v ultrafiltrátu a intracelulární koncentrace v PBMC. Byla Disertační práce Souhrn vyvinuta citlivá a selektivní metoda HPLC/MS/MS, která umožňuje kvantifikovat efavirenz ve všech třech biologických materiálech. Také byly vyvinuty jednoduché postupy izolace EFV z jednotlivých biologických materiálů. Vyvinutá metoda byla nakonec využita při hodnocení vzorků 14 zdravých dobrovolníků. Disertační práce Souhrn
Abstract v angličtině:
Introduced dissertation thesis deals with the development and validation of the chromatographic methods for analytical evaluation of selected biologically active substances. HPLC coupled with UV and MS detection was chosen for determination of analytes, because of the dominant role of the HPLC in pharmaceutical analysis. The theoretical part is focused on the theory of chromatographic methods and topics of the experimental work. At first, summary of all the chromatographic methods is briefly introduced and subsequently, the most common analytical method HPLC is described in details. The next part deals with the mass spectrometry. Thank to its high sensitivity and ability to provide structural information about the analytes, MS became an indispensable tool not only in modern pharmaceutical analysis. Besides MS theory and instrumentation, its applications and new trends are also mentioned. Last chapters deal with the transdermal application of drugs, specifications of antiretroviral therapy and especially they provide basic information about the physical - chemical and biological properties of analysed substances. The experimental part is consisted of the original research papers with appropriate comments divided into two thematic sections. The first one is composed of three papers focused on analytical determination of the novel accelerant of transdermal penetration – transkarbam 12. The second section deals with the analytical determination of antiretroviral efavirenz in biological material. The first thematic section deals with the development and validation of the chromatographic methods suitable for analytical determination of Transkarbam 12 (T 12). This new accelerant of transdermal penetration was developed at the Faculty of Pharmacy in Hradec Králové in the nineties and it was patented in 2001. The limited availability of highly effective accelerants in clinical practise was the main reason which initiated this development. In fact, Azon® has been the only, clinically widely used accelerant since 1976. Introduction of a new and highly effective accelerant can significantly contributes into the widespread of transdermal drug delivery which is an advantageous alternative to another, commonly used drug delivery. Because of the absence of any analytical method for determination of T 12, it was necessary for its introduction to pharmaceutical praxis, to develop and validate chromatographic methods, which allow impurity and stability determination of T 12. At first, fast, easy and inexpensive TLC method was developed for the evaluation of T 12 and its two hydrolytic degradation products 6-aminohexanoic acid (AH) and dodecanol (D). Derivatization of the sample using benzoyl chloride was needed before each analysis, because of absence of the chromophore in the structure of T 12, as well as in degradation products. Beside TLC, in this pilot study HPLC/UV method was also developed to obtain sufficient separation of T 12 from the derevatization reagent and/or side products of the derivatization reaction. Further experimental work was focused on the development of a new HPLC/UV method, which enabled simultaneous determination of T 12 and its degradation products - AH a D. Due to the low sensitivity of the previously used derivatization, the new derivatization reagent (3,5- dinitrobenzoyl chloride) was chosen in these experiments and whole derivatization process was newly optimized. However, it was obvious that time-consuming derivatization is not suitable for routine use in pharmaceutical manufacturing. Therefore, further effort was focused on searching for an alternative for elimination of this time-consuming step. Thus, mass spectrometry was chosen as a proper method, which allows to determine the analytes according to their m/z ratio and therefore it requires no chromophore in the structure of the analytes. Novel HPLC/MS method developed and validated in this study, allowed sensitive determination of purity and stability of the T 12 substance. Following impurities can be evaluated: AH – hydrolytic degradation product, CA – initial substance for T 12 synthesis and DAH – side product of the synthesis. DAH was discovered and identified as a novel T 12 impurity during HPLC/MS method development. Currently, this HPLC/MS method is used by T 12 manufacturer to determine impurity and stability of T 12 bulk substance. Considering the need to quickly introduce novel method for analytical evaluation of T 12 to pharmaceutical practice, the time available for the method development was limited. Therefore ideal optimization of all method parameters was not done. Total analysis time and gradient profile of the method are the main drawbacks. Hence, further work was concentrated to overcome these disadvantages. Currently, a new scientific paper describing the development and validation of the novel isocratic HPLC/MS method with 12 min of the total analysis time is prepared. The second thematic section is focused on analytical determination of efavirenz in biological material. This work was a part of a wide clinical study proceeded in cooperation with other research laboratories wordwide at Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, Germany. Efavirenz is recommended by WHO for medication of HIV infection in African countries. As well as most of other antiretrovirotics, efavirenz (EFV) is characterized by high inter-individual variability of plasmatic concentrations. Hence, antiretrovirotics belong to the drugs recommended for therapeutic drug monitoring in order to adjust dose for particular patient individually. CYP-450 is extensively involved in EFV biotransformation. The high risk of drug- drug interaction can be expected in HIV/TBC co infection, where rifampicin, other potential CYP-450 inducer, is recommended as a first line drug. In this case the analytical method capable to determine the concentration profile of EFV in biological material is of particular importance. Presented part of the project was focused on the development and validation of chromatographic methods suitable to determine concentration of EFV in three biological materials plasma, ultrafiltrate and intracellular concentration in PBMC. A new, highly sensitive method HPLC/MS/MS was developed for determination of EFV in these biological materials. Isolation processes of EFV from each biological material were developed as well. Finally this method was used for the determination of EFV in samples taken from 14 healthy volunteers receiving EFV.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Ivana Pasáková, Ph.D. 12.97 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Ivana Pasáková, Ph.D. 182 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Ivana Pasáková, Ph.D. 151 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Doc. RNDr. Jaroslav Sochor, CSc. 128 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. PharmDr. Milan Nobilis, CSc. 716 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Ing. Michal Holčapek, Ph.D. 27 kB