velikost textu

Increasing affinity of Interferon gamma receptor 1 to Interferon gamma by combining molecular modeling and experimental methods

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Increasing affinity of Interferon gamma receptor 1 to Interferon gamma by combining molecular modeling and experimental methods
Název v češtině:
Zvýšení afinity receptoru 1 pro interferon gama k interferonu gama kombinací molekulárního modelování a experimentálních metod
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Pavel Mikulecký
Školitel:
Ing. Bohdan Schneider, D.Sc. (Tech.), CSc., DSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D.
RNDr. Ondřej Vaněk, Ph.D.
Id práce:
97475
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
22. 10. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
interferon gamma, receptor, cytokin
Klíčová slova v angličtině:
interferon gamma, receptor, cytokine
Abstrakt:
Abstrakt Téměř ve všech dějích živých buněk hraje interakce mezi proteiny důležitou roli a funkce mnohých proteinů je závislá na jejich specifické interakci s ostatními biomolekulami. Pro vývoj molekul vhodných pro diagnostiku, medicínu a biotechnologie by bylo velmi přínosné, kdybychom měli k dispozici nástroje k ovlivňování interakcí mezi proteiny. Tato práce se zabývala specificitou interakcí mezi proteiny na modelovém příkladu receptoru 1 pro interferon gama (IFNgR1) a jeho přirozeném vazebném ligandu interferonu gama (IFNg), jehož funkce je důležitá pro přirozenou imunitu. Při hledání mutací proteinu IFNgR1, které by měly měnit jeho vazbu (zvýšit nebo snížit) k IFNg, byla použita počítačová in silico analýza dostupných krystalových struktur komplexu mezi IFNgR1 a IFNg. Záměny aminokyselin byly počítačově modelovány a jejich vliv na interakci byl počítán programem FoldX. Všechny varianty receptoru 1, které vyhovovaly kritériím výběru, byly produkovány v bakterii Escherichia coli, dále purifikovány, charakterizovány a jejich interakce byla změřena na přístroji SPR, jenž měří povrchovou rezonanci plazmonů (Surface Plasmon Resonance). První skupina variant IFNgR1 obsahovala mutace na interakčním rozhraní s IFNg. Z SPR měření vyplývá, že většina těchto variant vykazovala stejnou vazbu k IFNg jako nezměněný „wild-type“ receptor, několik variant mělo vazbu lehce zvýšenou, nicméně další varianty měly vazbu silnější. Druhá skupina variant obsahovala mutace, které se nacházely buď přímo, nebo v blízkém okolí kavit uvnitř molekuly IFNgR1. Tento přístup je méně obvyklý. Ačkoliv výsledky ukazovaly, že tyto mutace samy o sobě ovlivňují vazbu mezi receptorem a IFNg velmi málo, dvě varianty kombinující mutaci na rozhraní s mutací v kavitě měly výrazně zvýšenou vazbu. Naše výsledky ukázaly, že lze získat varianty IFNgR1 s vyšší vazbou k IFNg pomocí kombinace experimentálních přístupů spolu s počítačovými návrhy, které využívají poměrně jednoduché a přístupné protokoly. Vývoj nových molekul s vysokou afinitou pomáhá k lepšímu pochopení sil, které se uplatňují při interakcích mezi proteiny. Tyto nově vyvinuté mutanty přirozených proteinů by se rovněž mohly stát základem pro nové diagnostické nástroje.
Abstract v angličtině:
Abstract Protein-protein interactions play an important role in nearly all processes of the living cells and the function of many proteins is dependent on their specific interactions with other biomolecules. A reliable tool to modulate these interactions would be invaluable for the development of molecules suitable for diagnostics, medicine, and biotechnology. In this work, we aimed to study the specificity of interactions in the model system of Interferon gamma receptor 1 (IFNgR1) and its natural ligand Interferon gamma (IFNg), important in innate immunity. We searched for mutations within the interferon receptor molecule IFNgR1 to modulate (increase as well as decrease) its affinity to IFNg by in silico analysis of the existing crystal structures of the complex between IFNgR1 and IFNg. We modeled amino acid substitutions and gauged how they influenced the interaction using empirical force field implemented in software FoldX. All selected promising IFNgR1 variants were expressed in Escherichia coli, purified to homogeneity, characterized, and kinetics of their interactions with IFNg was measured by Surface Plasmon Resonance (SPR). The first set of IFNgR1 variants included mutations on the interface of the IFNg/IFNgR1 complex. According to our SPR measurements, the affinity of most of these receptor variants had virtually the same affinity as the wild-type receptor, a few had affinity slightly decreased, but a few variants bound IFNg with significantly higher affinity. The second, less orthodox approach comprised single mutations within the cavities of the IFNgR1 molecule. The results of these calculations suggested that they influenced the receptor affinity to IFNg very little. However, two cavity mutations increased the IFNgR1 affinity significantly in combination with the interface mutations. Our results demonstrated that the combination of a computer-aided design using a relatively simple and accessible computational protocol together with experimental approaches was capable of predicting IFNgR1 variants with significantly increased affinity to IFNg. These new high-affinity binders help in better understanding of forces governing protein-protein interactions and could be developed into a new diagnostic tool.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Pavel Mikulecký 11.52 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Pavel Mikulecký 109 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Pavel Mikulecký 8 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Pavel Mikulecký 1.05 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D. 131 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Ondřej Vaněk, Ph.D. 411 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 639 kB