velikost textu

Acetyl - CoA karboxylasa - evoluce a inhibice

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Acetyl - CoA karboxylasa - evoluce a inhibice
Název v angličtině:
Acetyl - CoA carboxylase - evolution and inhibition
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Dominika Chalupská, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Noemi Čeřovská, CSc.
Oponenti:
Dr. rer. nat. Ing. Helena Plchová
RNDr. Čestmír Vlček, Ph.D.
Id práce:
95715
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
17. 12. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
acetyl-CoA karboxylasa; herbicidy; pšenice; zdraví lidí
Klíčová slova v angličtině:
acetyl-CoA carboxylase; herbicides; wheat; human health
Abstrakt:
Abstrakt Acetyl‐CoA karboxylasa (ACC) je klíčovým enzymem metabolismu mastných kyselin. U eukaryot se často vyskytuje v mnoha isoformách a v různých buněčných kompartmentech. V zemědělství jsou inhibitory plastidové ACC používány jako účinné herbicidy travinných plevelů. Problémem se ale stává resistence některých populací travinných plevelů vůči používaným herbicidům aryloxyfenoxypropionatům (APPs) a cyklohexandionům (CHDs). Pomocí PCR a sekvenování bylo u resistentních rostlin populací Avena sterilis ssp. ludoviciana Durieu z obilnářské oblasti severní Austrálie nalezeno pět aminokyselinových substitucí v plastidové ACC: Trp‐1999‐Cys, Trp‐2027‐Cys, Ile‐2041‐Asn, Asp‐2078‐Gly a Gly‐2096‐Ala. S použitím kvasinkového ”gene‐replacement“ systému jsme ukázali, že každá z těchto mutací způsobuje resistenci k herbicidům i u pšeničné plastidové ACC: Asp‐2078‐Gly způsobuje resistenci k APPs a CHDs, Trp‐2027‐Cys a Ile‐2041‐Asn způsobují resistenci k APPs a Trp‐1999‐Cys způsobuje resistenci pouze k fenoxapropu. Tyto mutace by velmi pravděpodobně mohly způsobit resistenci kteréhokoli druhu travinných plevelů pod selekčním tlakem hojně používaných herbicidů. Lidská ACC představuje zajímavý cíl nových léčiv pro léčbu metabolického syndromu. Vyvinuli jsme finančně nenáročný neradioaktivní vysokokapacitní systém k identifikaci nových inhibitorů ACC. Testování využívá kvasinkové ”gene‐replacement” kmeny závisející svým růstem na klonované lidské ACC1 a ACC2. Pro ověření fungování tohoto systému byl růst zmíněných kmenů inhibován známými inhibitory lidské ACC. Testováním knihoven chemických sloučenin jsme nalezli nové specifické inhibitory lidské ACC2. Cíl působení nejlepšího z těchto inhibitorů byl potvrzen testováním enzymatické aktivity in vitro. Tato sloučenina inhibuje lidskou ACC2 s 2,8 μM IC50 a nemá ve 100 μM žádný účinek na lidskou ACC1. Sekvenci genu pro pšeničnou ACC jsme studovali také z evolučního hlediska. DNA sekvence lokusů pšeničných ACC1 a ACC2, kódujících plastidovou a cytosolovou formu ACC, byly analyzovány s cílem porozumět evoluci těchto genů a původu tří genomů v moderní hexaploidní pšenici. Byly sekvenovány lokusy ACC1 a ACC2 z pšeničných druhů Triticum urartu (genom A), Aegilops tauschii (genom D), Triticum turgidum (genom AB) a Triticum aestivum (genom ABD), a dva pseudogeny ACC2 z T. urartu. Tři homologní chromosomy se podle výpočtů na základě kódujících a intronových sekvencí genů ACC1 oddělily před 2,3‐ 2,4 miliony let, což je na dolní hranici jiných odhadů. Při kalibraci molekulárních hodin jsme vycházeli z doby oddělení pšenice a kukuřice před 60 miliony let. Ve stejném časovém měřítku se na základě sekvencí ACC a dalších genů oddělila pšenice a ječmen před 11,6 miliony let. Oblasti ohraničující ACC geny nejsou konservované mezi genomy A, B a D. Jsou konservované v porovnání homologních genomů diploidní, tetraploidní a hexaploidní pšenice. Frekvence substitucí v intergenových oblastech je proměnlivá a v průměru je 3,5 krát vyšší než frekvence substitucí v intronech.
Abstract v angličtině:
Abstract Acetyl‐CoA carboxylase (ACC) is a key enzyme of fatty acid metabolism with multiple isozymes often expressed in different eukaryotic cellular compartments. In agriculture, inhibitors of plastid ACC are used as efficient herbicides against grass weed. However, grass weed populations resistant to aryloxyphenoxypropionate (APP) and cyclohexanedione (CHD) herbicides represent a major problem for sustainable agriculture. Using PCR and sequencing it was found out that five amino acid substitutions in plastid ACC were correlated with herbicide resistance of Avena sterilis ssp. ludoviciana Durieu populations from the northern grain‐growing region of Australia: Trp‐1,999‐Cys, Trp‐2,027‐ Cys, Ile‐2,041‐Asn, Asp‐2,078‐Gly and Gly‐2,096‐Ala. We showed, using a yeast gene‐ replacement system, that these single‐site mutations also confer herbicide resistance to wheat plastid ACCase: Asp‐2,078‐Gly confers resistance to APPs and CHDs, Trp‐2,027‐Cys and Ile‐2,041‐Asn confer resistance to APPs, and Trp‐1,999‐Cys confers resistance only to fenoxaprop. These mutations are very likely to confer resistance to any grass weed species under selection imposed by the extensive agricultural use of the herbicides. ACC provides an important target for new drugs to treat human diseases. We have developed an inexpensive nonradioactive high‐throughput screening system to identify new ACC inhibitors. The screen uses yeast gene‐replacement strains depending for growth on cloned human ACC1 and ACC2. In “proof of concept” experiments, growth of such strains was inhibited by compounds known to target human ACCs. Chemical libraries yielded new specific inhibitors of human ACC2. The target of the best of these inhibitors was confirmed with in vitro enzymatic assays. This compound inhibits human ACC2 with 2.8 μM IC50 and has no effect on human ACC1 at 100 μM. We used the DNA sequence of wheat ACC also to study evolution. The DNA sequences of wheat ACC1 and ACC2 loci, encoding the plastid and cytosolic forms of the enzyme acetyl‐ CoA carboxylase, were analyzed with a view to understanding the evolution of these genes and the origin of the three genomes in modern hexaploid wheat. ACC1 and ACC2 loci from each of the wheats Triticum urartu (A genome), Aegilops tauschii (D genome), Triticum turgidum (AB genome), and Triticum aestivum (ABD genome), as well as two ACC2‐related pseudogenes from T. urartu were sequenced. The 2.3– 2.4 Mya divergence time calculated here for the three homoeologous chromosomes, on the basis of coding and intron sequences of the ACC1 genes, is at the low end of other estimates. Our clock was calibrated by using 60 Mya for the divergence between wheat and maize. On the same time scale, wheat and barley diverged 11.6 Mya, based on sequences of ACC and other genes. The regions flanking the ACC genes are not conserved among the A, B, and D genomes. They are conserved when comparing homoeologous genomes of diploid, tetraploid, and hexaploid wheats. Substitution rates in intergenic regions vary substantially along the loci and on average are 3.5‐fold higher than the ACC intron substitution rates.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Dominika Chalupská, Ph.D. 3.71 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Dominika Chalupská, Ph.D. 2.76 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Dominika Chalupská, Ph.D. 38 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Dominika Chalupská, Ph.D. 36 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Dominika Chalupská, Ph.D. 2.57 MB
Stáhnout Posudek oponenta Dr. rer. nat. Ing. Helena Plchová 102 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Čestmír Vlček, Ph.D. 56 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1 MB