velikost textu

Modulace nádorového mikroprostředí a její vliv na imunoterapii nádorů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Modulace nádorového mikroprostředí a její vliv na imunoterapii nádorů
Název v angličtině:
Tumor microenvironment modulation and the impact on cancer immunotherapy
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Jan Musil
Školitel:
RNDr. Šárka Němečková, DrSc.
Oponenti:
MUDr. Romana Mikyšková, Ph.D.
MUDr. Pavel Otáhal, PhD.
Id práce:
94866
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
23. 6. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
vakcinia virus, IGFBP3, HPV16, E7, TAM, makrofágy, legumain, nádorové mikroprostředí
Klíčová slova v angličtině:
vaccinia virus, IGFBP3, HPV16, E7, TAM, macrophages, legumain, tumor microenvironment
Abstrakt:
Abstrakt Modulace nádorového mikroprostředí představuje možnost, jak inhibovat růst nádorů a posílit protinádorovou imunitní odpověď. V předložené práci jsme použili pro modulaci nádorového mikroprostředí dvě strategie. Zaprvé, jsme zkonstruovali rVACV ko-exprimující tumor supresorový gen pro vazebný protein typu 3 pro růstové faktory podobné inzulinu (IGFBP-3) a gen kódující fúzní imunogen SigE7LAMP. Exprese IGFBP-3 byla řízena buď časným vakciniovým promotorem H5 nebo syntetickým časně/pozdním (E/L) promotorem. Zjistili jsme, že exprese IGFBP-3 řízená H5 promotorem vede k produkci většího množství proteinu než exprese řízená E/L promotorem. Imunizace myší rVACV P13-SigE7LAMP-H5- IGFBP-3 inhibovala růst nádorů TC-1 efektivněji než imunizace kontrolním virem P13-SigE7LAMP-TK-. Zároveň indukovala také silnější odpověď T-lymfocytů proti VACV antigenům. Pozorovali jsme, že vysoká exprese IGFBP-3 vedla ke zvýšení míry replikace viru a to jak in vitro, tak in vivo, což mělo za následek déletrvající antigenní stimulaci. Vysoká míra produkce IGFBP-3 rovněž korelovala s lepší adsorpcí viru P13-SigE7LAMP-H5-IGFBP-3 na buňky CV-1 v porovnání s P13-SigE7LAMP-TK-. Identifikovali jsme dva rozdíly ve struktuře IMV mezi viry P13-SigE7LAMP-H5-IGFBP-3 a P13-SigE7LAMP-TK-. IMV P13-SigE7LAMP-H5-IGFBP-3 do své struktury inkorporovaly protein IGFBP-3 a navíc obsahovaly větší množství fosfatidylserinu ve své vnější membráně, což pravděpodobně způsobilo zvýšený příjem těchto IMV buňkami prostřednictvím makropinocytózy. Pro měření obsahu PS jsme použili průtokovou cytometrii, kdy jsme purifikované viriony VACV imobilizovali pomocí protilátek na mikrokuličkách. Zadruhé, jsme zkonstruovali DNA vakcínu proti asparaginylové endopeptidáze legumain, která je ve vysoké míře exprimována M2 polarizovanými TAM. Pro zvýšení efektivity DNA imunizace proti legumainu, jsme navrhli několik modifikací jeho aminokyselinové sekvence. Tyto zahrnovaly mutagenezi RGD motivu, která vedla k inhibici maturace legumainu a změnu v buněčné lokalizaci. Dále jsme provedli inzerci pomocného epitopu p30 odvozeného od tetanového toxinu, který je schopný aktivovat pomocné CD4+ T-lymfocyty. Obě použité modifikace signifikantně posílily imunitní odpověď proti legumainu. Jejich kombinace ovšem další signifikantní zvýšení nepřinesla. DNA vakcinace indukuje TH1 i TH2 odpověď, z nichž pouze TH1 podporuje indukci protinádorové CD8+ CTL. Pro posílení TH1 a CTL odpovědi jsme použili adjuvans CpG-ODN nebo depleci Treg pomocí protilátky proti CD25. Podání CpG-ODN nemělo žádný efekt. Deplece Treg ovšem signifikantně posílila imunitní odpověď indukovanou konstruktem LgmnRGG.TT1l. Imunizace za použití LgmnRGG.TT1l byla schopna signifikantně inhibovat růst nádorů, ale neovlivnila tvorbu plicních metastáz ani počet TAM.
Abstract v angličtině:
Summary Modulation of the tumor microenvironment represents a possible way to inhibit cancer growth and enhance anti-cancer immune responses. In the presented work we employ two strategies for tumor microenvironment modulation. Firstly, we have constructed rVACV co-expressing the tumor suppressor gene insulin-like growth factor-binding protein-3 (IGFBP- 3) and the fusion gene encoding the immunogen SigE7LAMP. The expression of IGFBP-3 was regulated either by the early vaccinia virus H5 promoter or by the synthetic early/late (E/L) promoter. We have shown that expression of IGFBP-3 regulated by the H5 promoter yielded higher amounts of IGFBP-3 protein when compared with the E/L promoter. Immunization with P13-SigE7LAMP-H5-IGFBP-3 was more effective in inhibiting the growth of TC-1 tumors in mice and elicited a higher T-cell response against VACV-encoded antigens than the control virus P13-SigE7LAMP-TK-. We found that high-level production of IGFBP-3 enhanced virus replication both in vitro and in vivo, resulting in profound antigen stimulation. Production of IGFBP-3 was associated with a higher adsorption rate of P13-SigE7LAMP-H5-IGFBP-3 to CV-1 cells when compared with P13-SigE7LAMP-TK-. We have identified two structural differences between the IMVs of the IGFBP-3 expressing virus P13-SigE7LAMP-H5-IGFBP-3 and P13-SigE7LAMP-TK-. The P13-SigE7LAMP-H5-IGFBP-3 IMVs incorporate the IGFBP-3 protein and they have elevated phosphatidylserine exposure on the outer membrane that could possibly result in increased uptake of these IMVs via macropinocytosis. The PS content of IMVs was measured by flow cytometry using microbeads covered with immobilized purified VACV virions. Secondly, we have developed a DNA vaccine against the asparaginyl endopeptidase legumain that is overexpressed in M2-polarized TAM. To enhance the efficacy of DNA immunization against legumain, we performed several modifications of the legumain protein. These include mutagenesis of the RGD motif that resulted in diminished maturation and changed cellular localization of the legumain protein. Furthermore we inserted the p30 helper epitope from the tetanus toxin, which is capable to induce CD4+ helper T-cells. Both modifications significantly enhanced the immune response against legumain. There was no further significant enhancement of the anti-legumain response when RGD mutation and p30 insertion were combined. DNA vaccination induces both TH1 and TH2 responses, of which only TH1 promotes the induction of anti-tumor CD8+ CTL. To enhance TH1 and CTL responses we used CpG-ODN as adjuvant or depleted Treg using an antibody against CD25. Although administration of CpG-ODN showed no effect, the depletion of Treg significantly enhanced the immune response elicited by LgmnRGG.TT1l. We were able to show that immunization using LgmnRGG.TT1l was capable to significantly inhibit tumor growth, but did not inhibit formation of pulmonary metastasis nor altered the amount of TAM.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Jan Musil 3.9 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Jan Musil 56 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Jan Musil 10 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Jan Musil 532 kB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Romana Mikyšková, Ph.D. 1.21 MB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Pavel Otáhal, PhD. 135 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 750 kB