velikost textu

Cytoskeleton and endocytosis, a dynamic system for the localization of auxin efflux carriers

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Cytoskeleton and endocytosis, a dynamic system for the localization of auxin efflux carriers
Název v češtině:
Cytoskelet a endocytóza;dynamický systém pro lokalizaci transferů auxinu z buněk
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Adriana Jelínková, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Jan Petrášek, Ph.D.
Oponenti:
Prof.Dr. Peter Nick
Ing. Jiří Hašek, CSc.
Id práce:
94112
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra experimentální biologie rostlin (31-130)
Program studia:
Anatomie a fyziologie rostlin (P1524)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
7. 9. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Abstrakt Hlavním cílem této disertační práce bylo popsat roli cytoskeletu a vesikulárního transportu v procesech směrovaného ukládání přenašečů auxin ven z buněk do místa jejich působení, tj. do plazmatické membrány. Propojení mezi transportem auxinu, transportem vesikulů (proteinů) a aktinovým cytoskeletem bylo již v minulosti naznačeno. V naší předchozí práci bylo zjištěno, že v buňkách tabákové kultury BY-2 inhibitor anterográdního transportu brefeldin A (BFA) zpomaluje tok auxinu z buněk a způsobuje přestavbu aktinových filament. Tento účinek na stav aktinového cytoskeletu vyvolal řadu otázek: Jak souvisí stav aktinu s auxinovým transportem? Zdal-li funkční propojení aktinu s endomembránovým systémem je nezbytné pro cyklování auxinových přenašečů a tím pro jejich funkci. Výsledky prezentované v této disertační práci byly získány s použitím modelu buněčné linie tabáku BY-2 a semenáčků rostlin Arabidopsis thaliana. S využitím farmakologického přístupu a in vivo pozorování endocytózy a lokalizace proteinů PIN1 v tabákových buňkách BY-2 bylo poprvé navrženo, že endocytóza barvy FM 4-64 zprostředkovaná klatrinem je závislá jak na aktinové, tak i na mikrotubulární síti. Dále bylo ukázáno, že shlukování aktinu stimulované působením BFA pozorované v naší předchozí práci je zřejmě aktivní proces, neboť farmakologické narušení aktinu vedlo k drastickým změnám ve vzhledu shluků stimulovaných BFA. Toto nebylo pozorováno po použití inhibitorů mikrotubulární dynamiky. Navíc byly získány podrobné znalosti o působení inhibitorů endocytosy u rostlinných buněk: tyrfostinů, filipinu, wortmanninu a dynasoru. Během experimentů s rutinně užívanými in vivo FM styrylovými endocytickými barvami byl zjištěn jejich nečekaný účinek. S využitím fluorescenčně značených transportérů auxinu lokalizovaných na plazmatické membráně v tabákových buňkách BY-2 a v buněčné suspenzi Arabidopsis thaliana bylo pozorováno, že běžně používané koncentrace FM 4-64 a FM 5-95 způsobují přesun těchto proteinů a že FM 1-43 ovlivňuje jejich funkci. Tento aktivní proces re-lokalizace není blokován ani inhibitory endocytózy, ani inhibitory cytoskeletu. Zmíněný efekt nebyl pozorován u buněk kořenů Arabidopsis thaliana a závisí na stupni hydrofobicity příslušného FM barviva. Získané výsledky zdůrazňují potřebu obezřetnosti při studiu značených membránových proteinů in vivo souběžně s použitím FM barev. K prohloubení znalosti o účasti cytoskeletu v procesech transportu membránových váčků a směrovaném ukládání proteinů v celistvé rostlině byla zahájena fenotypová studie všech dostupných mutantů v genech kódujících cytoskeletální a asociované proteiny v huseníčku Arabidopsis thaliana. U doposud získaných mutantních rostlin byla testována rychlost 78 endocytózy pomocí FM 4-64 a současně byla sledována změna lokalizace proteinu PIN1 v kořenové špičce Arabidopsis thaliana. Cílem této doposud probíhající studie, je identifikace nových faktorů podílejících se na polárním umísťování PIN proteinů. Zde prezentovaná data, která představují její první část, zahrnují všechny nám dostupné mutantní linie v genech kódujících aktiny, v proteinech Arp 2/3 komplexu, jeho podjednotkách a aktivátorech WAVE a v proteinech vázajících se na na monomery aktinu. Získané výsledky naznačují, že aktin zřejmě nehraje přímou roli v ukotvení proteinů PIN1 na bazální část plazmatické membrány buněk středního válce kořene. Vzhledem k tomu, že největší dopad na endocytózu a částečně také na lokalizaci proteinu PIN1 měly mutace v komplexu Arp 2/3 a jeho podjednotkách, dá se předpokládat že je to právě dynamika aktinu, která je nezbytná pro směrovaný transport endomembránových váčků ve směru od plasmatické membrány. Různé poruchy v endocytóze byly pozorovány i u mutantů v aktinu a regulačních faktorech jeho polymerace. Pro ucelenější představu o účasti cytoskeletálních proteinů v polárním směrování PIN proteinů je nutné doplnit tuto studii o další mutanty v aktin-asociovaných proteinech, tubulinech a jejich asociovaných proteinech. Potřebné mutantní rostliny (případně i dvojití mutanti) budou objednány z NASC a získány od jiných výzkumných týmů. Shrneme-li výsledky této disertační práce, lze jak u modelu buněk BY-2 tak i u kořenů Arabidopsis konstatovat, že aktinová vlákna pravděpodobně nejsou tak důležitý pro polární umísťování a lokalizaci PIN1 proteinů na bazální stranu plasmatické membrány. Nicméně, intaktní aktinová dynamika jsou nepostradatelná pro endomembránový transport, tvorbu endocytických váčků a jejich dynamiku, tedy procesy hrající klíčovou úlohu ve směrování a cyklování PIN1 proteinů. Je možné, že neporušená aktinová dynamika je důležitá pro transport váčků, zatímco endosomy jako organely ve kterých probíhá třídění proteinů se pohybují do míst svého budoucího působení (plazmatická membrána, trans-Golgiho aparát a vakuola) podél mikrotubulů, podobně jako je tomu u savčích buněk. Budoucí výzkum zaměřený na dokončení popsané fenotypové studie a následné využití markerů endosomálního systému spolu s genetickými a farmakologickými manipulacemi aktinových a tubulinových proteinů a jejich interaktorů napomůže k objasnění této problematiky.
Abstract v angličtině:
Abstract Thanks to its sessile life strategy, the polarity of plant body reflects the polarity of single cells. The polarity is maintained by asymmetric distribution of various molecules downstream from extra and intracellular signals. Directional transport of auxin plays an important role in the pattern formation, morphogenesis, and directional growth responses. The positioning of PIN auxin efflux transporters has been shown to be crucial in the setting of auxin gradients. It is dependent on the plasma membrane deposition of membrane vesicles and their constitutive cycling between plasma membrane and endosomal space. Although some evidences support the idea of differential actin and microtubular cytoskeleton dependence of PIN protein trafficking, there is a significant lack of the information on the role of cytoskeleton in this process. In this paper we use combination of live cell imaging and immunofluorescence techniques to search for the molecular players of actin filaments (AFs) and proteins proteins associated with AFs in the mechanisms of endocytosis and directed PIN1 protein targeting. Seedlings of Arabidopsis thaliana carrying mutations in actin genes (ACT1, ACT2, ACT7, ACT11), Arp 2/3 complex genes (ARP2, ARP3, ARPC2, ARPC5), WAVE complex components genes (BRK1, NAP1, SRA1) and actin monomer binding proteins genes (ADF1, ADF4, ADF5, PRF1, PRF2) were tested for the the rate of the endocytosis using FM-4-64 uptake by root epidermal and cortex cells. Simultaneously, PIN1 protein was immunolocalized in whole mounts by indirect immunofluorescence. We show here that with only few exceptions all mutations presented here either reduced the rate of FM 4-64 endocytosis and its progression or changed the appearance of endocytic vesicles. The localization of PIN1 in the root tip stele cells did not show any significant changes in all mutants screened here with one exception. Plant carrying the mutation in the ARPC5 gene coding for the subunit of Arp2/3 complex had prominent PIN1 plasma membrane staining and some granulated signal through the cytoplasm. Our results suggest that actin and actinassociated proteins analyzed here seem to be not primarily important for PIN1 localization within the basal plasma membrane of root provasculature. However, they are essential for proper membrane trafficking and endocytic vesicle formation and dynamics which makes in turn part of the PIN1 protein targeting and cycling. The analysis of other mutations is in progress
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Adriana Jelínková, Ph.D. 9.65 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Adriana Jelínková, Ph.D. 106 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Adriana Jelínková, Ph.D. 9 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Jan Petrášek, Ph.D. 1.17 MB
Stáhnout Posudek oponenta Prof.Dr. Peter Nick 136 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Jiří Hašek, CSc. 85 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby Magdalena Čuříková 1.7 MB