velikost textu

Studium enantioselektivity a syntézy β-laktamových antibiotik katalyzované penicilin G acylasou: biokatalýza a in-silico experimenty

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium enantioselektivity a syntézy β-laktamových antibiotik katalyzované penicilin G acylasou: biokatalýza a in-silico experimenty
Název v češtině:
Studium enantioselektivity a syntézy β-laktamových antibiotik katalyzované penicilin-G acylasou: biokatalýza a in-silico experimenty
Název v angličtině:
Study enantioselectivity and synthesis of β-lactam antibiotics catalyzed by penicilin G acylase: Biocatalysis and in-silico experiments
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Michal Grulich
Školitel:
RNDr. Pavel Kyslík, CSc.
Oponenti:
Michal Kotík, prom. mat.
prof. doc. RNDr. Mgr. Rüdiger Ettrich, Ph.D.
Konzultant:
doc. Ing. Josef Hájíček, CSc.
Id práce:
93934
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
9. 12. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
hydrolasa, rekombinantní mikroorganismus, imobilizace enzymu, enantioselektivita, biokatalyzátor
Klíčová slova v angličtině:
hydrolase, recombinant microorganism, enzyme immobilization, enantioselectivity, biocatalyst
Abstrakt:
Abstrakt Penicilin-G-acylasy (PGA) se řadí mezi enantioselektivní enzymy katalyzující hydrolýzu stabilní amidické vazby v rámci širokého spektra substrátů majících často velký aplikační potenciál. PGA z mikroorganismů Escherichia coli (PGAEc) a Achromobacter sp. CCM4824 (PGAA) byly použity pro katalýzu enantioselektivních hydrolýz sedmi vybraných N-fenylacetylovaných (N-PhAc) racemických směsí α/β-aminokyselin. Prokázali jsme, že PGAA vykazovala vyšší stereoselektivitu pro trojici (S)-enantiomerů: N- PhAc-β-homoleucin, N-PhAc-α-terc-leucin a N-PhAc-β-leucin. Dále byl zkonstruován homologní model PGAA, který byl použit pro molekulární modelování interakcí se stejnými substráty. In-silico experimenty zreprodukovaly experimentálně získaná data z enzymaticky katalyzovaných enantioselektivních hydrolýz, což potvrdilo věrohodnost připraveného homologního modelu. Stejný přístup jsme použili pro ověření enantiopreference PGAA vůči sedmi novým substrátům s aplikačním potenciálem, přičemž pro pětici z nich byla predikována vysoká enantioselektivita PGAA. PGAA byla dále použita v kineticky řízených syntézách β-laktamových antibiotik (SSBA). Enzym byl prokazatelně účinnější při syntéze ampicilinu a amoxicilinu (vyšší S/H poměr a akumulace produktu) oproti PGAEc. Analogicky k predikci enantioselektivity PGAA vůči novým substrátům bylo molekulární modelování aplikováno na syntézy SSBA katalyzované PGAA. Abychom zlepšili parametry syntéz SSBA, provedli jsme in-silico cílenou aminokyselinovou záměnu v pozicích Phe24β a Phe146α homologního modelu PGAA. Jako perspektivní modifikace se jevila záměna Phe24β→Cys, neboť vzdálenost mezi aminoskupinou nukleofilu (N) a karbonylovou skupinou acyl-donoru (AD) se zkrátila z 4,1 na 3,3 Å při syntéze amoxicilinu. Následně byl připraven expresní systém nesoucí mutovaný pgaA gen kódující tuto aminokyselinovou záměnu. Purifikovaná rekombinantní PGAAPheβ24Cys vykazovala v případě syntézy amoxicilinu i ampicilinu podobné hodnoty u všech parametrů jako PGAA. Rekombinantní PGAAPheβ24Cys byla dále použita pro syntézu amoxicilinu za molárního poměru AD/N 1,05 používaného v průmyslu a koncentrace nukleofilu: 1) nad 400 mM a 2) 160 mM. Účinnost PGAAPheβ24Cys při syntéze amoxicilinu za koncentrací nukleofilu nad 400 mM a molárního poměru AD/N 1,05 byla studována také ve své stabilizované formě, a sice v podobě CLEA. Hodnota S/H stabilizované formy vzrostla oproti rozpustné formě přibližně o 8 % (z hodnoty 4,9 na 5,0), avšak stupeň konverze se zvýšil výrazně, a to z 22 na 61 %. 10
Abstract v angličtině:
Abstract Penicillin G acylases (PGAs) belong among enantioselective enzymes catalyzing a hydrolysis of stable amide bond in a broad spectrum of substrates, often having high application potential. PGAEc from Escherichia coli and PGAA from microorganism Achromobacter sp. CCM 4824 were used to catalyze enantioselective hydrolyses of seven selected N-phenylacetylated (N-PhAc) α/β-amino acid racemates. The PGAA showed higher stereoselectivity for three (S) enantiomers: N-PhAc-β-homoleucine, N-PhAc-α-tert- leucine and N-PhAc-β-leucine. We have constructed a homology model of PGAA that was used in molecular docking experiments with the same substrates. In-silico experiments reproduced the data from experimental enzymatic resolutions confirming validity of employed modeling protocol. We employed this protocol to evaluate enantiopreference of PGAA towards seven new substrates with application potential. For five of them, high enantioselectivity of PGAA was predicted for. PGAA was further studied in kinetically controlled syntheses of β-lactam antibiotics (SSBA). The PGAA was significantly more efficient at synthese of ampicillin and amoxicillin (higher S/H ratio and product accumulation) compared with PGAEc. Analogously to prediction of enantioselectivity of PGAA towards new substrates this protocol was applied for SSBA syntheses catalyzed by PGAA. To improve parameters of SSBA syntheses, we performed in-silico directed modification of PGAA at position Phe24β and Phe146α. As a promising modification appeared to be PGAA Phe24β→Cys. The distance between the NH2 group of nucleophile and carbonyl group of acyl-donor dropped from 4.1 Å to 3.3 Å for amoxicillin. We subsequently constructed pgaA gene encoding this amino acid modification. The gene was expressed and recombinant PGAAPheβ24Cys was purified. The enzyme exhibited very similar values of all tested parameters in syntheses of amoxicillin and ampicilin compared with PGAA. The recombinant PGAAPheβ24Cys was further tested in the synthesis of amoxicillin under industrial conditions 1) at a concentration of nucleophile above 400 mM and the molar ratio AD / N 1.05 and 2) at a concentration of nucleophile of 160 mM and the same molar ratio. Efficiency of stabilized Pheβ24Cys as CLEA was studied in synthesis of amoxicillin at nucleophile concentrations above 400 mM and the molar ratio AD / N 1.05. The value of S / H has increased compared with the soluble form of approximately 8% (from the value of 4.9 to 5.0). The degree of conversion increased greatly, from 22 to 61%. 11
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Michal Grulich 4.27 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Michal Grulich 3.66 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Michal Grulich 28 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Michal Grulich 23 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Michal Grulich 1.41 MB
Stáhnout Posudek oponenta Michal Kotík, prom. mat. 2.94 MB
Stáhnout Posudek oponenta prof. doc. RNDr. Mgr. Rüdiger Ettrich, Ph.D. 804 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1016 kB
Stáhnout Errata Mgr. Michal Grulich 220 kB