velikost textu

Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Signaling effects of adenylate cyclase toxin action on phagocytes
Název v češtině:
Signalizační působení adenylát-cyklázového toxinu na fagocyty
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Ondřej Černý
Školitel:
doc. Ing. Peter Šebo, CSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D.
doc. RNDr. Petr Dráber, DrSc.
Id práce:
93184
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
22. 10. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
adenylátcyklázový toxin, makrofág, neutrofil, reaktivní kyslíkové radikály, reaktivní dosíkové radikály, cAMP, fosforylace, kinasová aktivita
Klíčová slova v angličtině:
adenylate cyclase toxin, macrophage, neutrophil, reactive oxygen species, reactive nitrogen species, cAMP, phosphorylation, kinase activity
Abstrakt:
Abstrakt Adenylát-cyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertussis. CyaA se váže na fagocyty produkující komplementový receptor 3 (CR3) a následně katalyzuje přeměnu vnitrobuněčného ATP na významného „druhého posla“ cAMP. Tímto paralyzuje schopnost neutrofilů a makrofágů zabíjet bakterie pomocí oxidativního vzplanutí a mechanismů závislých na fagocytóze. V této práci analyzujeme mechanismus, kterým CyaA blokuje produkci baktericidních reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů neutrofily a makrofágy. CyaA potlačuje produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS, z angl. „reactive oxygen species“) jednak prostřednictvím inhibice PLC přes PKA a dále nejspíše ovlivněním skládání komplexu NADPH oxidázy prostřednictvím aktivace proteinu Epac. Selektivní aktivace PKA nebo Epac blokovala produkci ROS indukovanou fMLP. Inhibice PKA pomocí specifických inhibitorů navíc vedla jen k částečnému obnovení produkce ROS u neutrofilů vystavených CyaA. Signalizace CyaA/cAMP následně omezila tvorbu DAG, zatímco tvorba PIP3 zůstala neovlivněna. Tyto výsledky naznačují, že působení CyaA může ovlivnit lipidické složení membrány fagocytů. Dále jsme ukázali, že aktivace PKA pomocí cAMP vyvolává aktivaci tyrozínové fosfatázy SHP-1. To v makrofázích způsobí potlačení produkce reaktivních dusíkových radikálů (RNS, z angl. „reactive nitrogen species“). Selektivní aktivace PKA pomocí 6- Bnz-cAMP utlumila v makrofázích expresi iNOS stimulovanou LPS. Účinek toxinu byl pak zablokován po inhibici PKA. Signalizace CyaA/cAMP dále vyvolala defosforylaci c-Fos podjednotky transkripčního faktoru AP-1 v závislosti na aktivaci SHP-1, což vedlo ke zrušení exprese iNOS vyvolané signalizací TLR4. Snížení hladiny SHP-1 pomocí siRNA vedlo k obnovení produkce RNS v makrofázích aktivovaných TLR4 ligandy. Inhibice SHP fosfatáz nakonec snížila přežívání B. pertussis v makrofázích. Tyto výsledky odhalují novou signální dráhu, kterou cAMP aktivuje fosfatázu SHP-1 prostřednictvím aktivace signalizace PKA. SHP-1 pak může v leukocytech regulovat aktivitu celé řady receptorů. Působení CyaA tak prostřednictvím aktivace SHP-1 umožňuje B. pertussis uniknout před zabitím makrofágy produkujícími RNS. Na základě získaných mechanismů jsme navrhli model signalizace vyvolané CyaA, kterou bakterie B. pertussis používá k potlačení baktericidní aktivity fagocytů hostitele.
Abstract v angličtině:
Abstract The adenylate cyclase toxin (CyaA) plays a key role in the virulence of Bordetella pertussis. CyaA penetrates CR3-expressing phagocytes and catalyzes the uncontrolled conversion of cytosolic ATP to the key second messenger molecule cAMP. This paralyzes the capacity of neutrophils and macrophages to kill bacteria by oxidative burst and opsonophagocytic mechanisms. Here we show that CyaA suppresses the production of bactericidal reactive oxygen and nitrogen species in neutrophils and macrophages, respectively. The inhibition of reactive oxygen species (ROS) production is most-likely achieved by the combined PKA-dependent inhibition of PLC and Epac-dependent dysregulation of NADPH oxidase assembly. Activation of PKA or Epac interfered with fMLP-induced ROS production and the inhibition of PKA partially reversed the CyaA-mediated inhibition of ROS production. CyaA/cAMP signaling then inhibited DAG formation, while the PIP3 formation was not influenced. These results suggest that cAMP produced by CyaA influences the composition of target membranes. We further show here that cAMP signaling through the PKA pathway activates the tyrosine phosphatase SHP-1 and suppresses the production of reactive nitrogen species (RNS) in macrophages. Selective activation of PKA interfered with LPS- induced iNOS expression in macrophages, while the inhibition of PKA largely restored the production of iNOS in CyaA-treated murine macrophages. CyaA/cAMP signaling induced SHP phosphatase-dependent dephosphorylation of the c-Fos subunit of the transcription factor AP-1 and thereby inhibited the TLR4-triggered induction of iNOS gene expression. Selective siRNA knockdown of the phosphatase SHP-1 then rescued the production of TLR-inducible RNS in toxin-treated cells. Finally, the inhibition of SHP phosphatase abrogated B. pertussis survival inside murine macrophages. These results reveal that an as yet unknown cAMP-activated signaling pathway controls SHP-1 phosphatase activity and may regulate numerous receptor signaling pathways in leukocytes. The hijacking of SHP-1 by CyaA action then enables B. pertussis to evade RNS-mediated killing inside macrophages. In conclusion, we propose a model of CyaA-provoked signaling which allows Bordetella pertussis to evade killing by the sentinel cells of the host immune system.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Ondřej Černý 3.32 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Ondřej Černý 172 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Ondřej Černý 102 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Ondřej Černý 911 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D. 329 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Petr Dráber, DrSc. 329 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 779 kB