velikost textu

Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Heterologní exprese a purifikace lidského cytochromu b5
Název v angličtině:
Heterologous expression and purification of human cytochrome b5
Typ:
Bakalářská práce
Autor:
Bc. Marie Kostelanská
Vedoucí:
RNDr. Věra Černá, Ph.D.
Oponent:
RNDr. Lucie Bořek Dohalská, Ph.D.
Id práce:
93142
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Chemie (B1407)
Obor studia:
Chemie a matematika se zaměřením na vzdělávání (UBCHM)
Přidělovaný titul:
Bc.
Datum obhajoby:
19. 9. 2011
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
cytochrom b5, cytochromy P450, exprese proteinu, bakterie E. coli, solubilizace, izolace
Klíčová slova v angličtině:
cytochrome b5, cytochromes P450, protein expression, bacterium E. coli, solubilization, isolation
Abstrakt:
ABSTRAKT Při metabolismu xenobiotik a endogenních látek se uplatňuje monooxygenasový systém, jehož součástí je i cytochrom b5 participující na katalytické činnosti cytochromů P450 (CYP). Mechanismus působení cytochromu b5 v tomto souboru enzymů však nebyl doposud zcela objasněn. Předpokládá se, že se buď přímo podílí na přenosu elektronů v rámci monooxygenasového systému, nebo může alostericky působit na konformaci CYP. Proto je důležité získat co nejčistší apoformu cytochromu b5, která není schopna přenosu elektronů, a dále studovat vliv této nehemové formy cytochromu b5 na činnost CYP. Získané výsledky pak mohou přispět k poznání mechanismu působení cytochromu b5. V průběhu této práce byla provedena transformace bakteriálního kmene buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold expresním vektorem pET22b, který nesl geny pro mikrosomální a erytrocytární formu cytochromu b5. Za účelem produkce vysokého podílu apoproteinové formy byla heterologní exprese cytochromu b5 indukována vyšším přídavkem IPTG a byla provedena při 37°C. Tato bakalářská práce se pak zabývá zejména purifikací jak mikrosomální, tak i erytrocytární formy cytochromu b5 a to hlavně jeho apoformy. Jelikož však při expresi dochází vždy ve větší či menší míře i k produkci hemové formy cytochromu b5, byla i ta izolována. Holo- a apoproteinová forma mikrosomálního i erytrocytárního cytochromu b5 byla během izolace rozdělena a zpracována odděleně. K purifikaci byly využity chromatografické metody na koloně s DEAE-Sepharosou pro mikrosomální formu a DEAE-Sepharosou a Sephadexem G-75 pro erytrocytární formu. Zachovaná nativní struktura apo-cytochromu b5 byla ověřena jeho schopností znovu do své molekuly přijmout hem. Klíčová slova: cytochrom b5, cytochromy P450, exprese proteinů, bakterie E. coli, solubilizace, izolace
Abstract v angličtině:
ABSTRACT The metabolism of xenobiotics and endogenous substances is mediated by a mixed function oxidase system which includes cytochrome b5 participating in catalytic activities of CYP. The mechanism of action of the cytochrome b5 has not been fully elucidated yet. But it is assumed that cytochrome b5 is involved either in direct electron transfer within the mixed function oxidase system or in induction of conformational changes in CYPs. So it is important to gain the pure form of apo-cytochrome b5, devoid of heme, which is not capable of electron transfer and further study the effect of this form on CYP-catalyzed reactions. The obtained results can contribute to understanding the mechanism of cytochrome b5 effects. The transformation of bacterial cells of Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold was performed by expression vector pET22b which contained genes for microsomal and erythrocyte cytochrome b5. In order to produce a high level of apoprotein form, the heterologous expression of cytochrome b5 was induced by addition of higher amount of IPTG. Expression was performed at 37°C. This bachelor thesis is primarily engaged in purification of both microsomal and erythrocyte form of cytotochrom b5, especially in its apo-form. However, the productions of holo-cytochrome b5 form always occur in a greater or lesser extent during the expression, so this was also isolated. During isolation, holo- and apoprotein form of microsomal and erythrocyte cytochrom b5 were divided and processed separately. Microsomal apo-cytochrome b5 was purified by chromatography on DEAE-Sepharose and erythrocyte on DEAE-Sepharose and Sephadex G-75. The native structure of apo-cytochrome b5 was verified by its ability to accept the heme group in its molecule by titration with hemin. Keywords: cytochrome b5, cytochromes P450, protein expression, bacterium E. coli, solubilization, isolation (In Czech)
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Marie Kostelanská 2.46 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Marie Kostelanská 68 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Marie Kostelanská 66 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Věra Černá, Ph.D. 160 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Lucie Bořek Dohalská, Ph.D. 193 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby RNDr. Petr Šmejkal, Ph.D. 81 kB