velikost textu

Non - covalent interactions in fundamental biological processes

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Non - covalent interactions in fundamental biological processes
Název v češtině:
Nekovalentní interakce v základních biologických procesech
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Vojtěch Klusák
Školitel:
RNDr. Lubomír Rulíšek, Ph.D.
Oponenti:
prof. RNDr. Ing. Jaroslav Burda, DrSc.
prof. RNDr. Jiří Šponer, DrSc.
Id práce:
92458
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyzikální a makromol. chemie (31-260)
Program studia:
Fyzikální chemie (P1404)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
16. 6. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Physical and Macromolecular Chemistry Non-covalent interactions in fundamental biological processes Doctoral Thesis Abstract Mgr. Vojtěch Klusák Supervisor: Mgr. Lubomír Rulíšek, CSc. Institute of Organic Chemistry and Biochemistry AS CR Center for Biomolecules and Complex Molecular Systems Praha 2010 Úvod Klíčem k pochopení vlastností a chování biomolekul je porozumění jejich vzájemným interakcím, ať už jde o interakce mezi nimi jako celky či mezi jejich jednotlivými částmi, (např. funkčními skupinami) .Snaha o pochopení vztahu mezi strukturou a funkcí na úrovni atomů či elektronů nás často dovádí za hranice možností či rozlišení experimentálních metod. Moderní nástroje výpočetní chemie nám však často s dostatečnou mírou přesnosti a spolehlivosti umožňují popsat tyto detaily studovaných procesů a doplnit tak naše znalosti a přiřadit k měřitelným veličinám určité strukturní vlastnosti. Za normálních podmínek, za kterých se biomolekuly při buněčných procesech přeskupují a seskupují (například při sbalování proteinů, formování a přeskupování membrán, při buněčné signalizaci) nedochází ke vzniku a zániku kovalentních vazeb. Takovéto procesy jsou z velké míry řízeny nekovalentními interakcemi. Tyto interakce jsou sice poměrně slabé, jejich celkový počet je však veliký. Rovnováha mezi různými strukturními formami bílkovin, vazebné rovnováhy, rovnováha mezi utvořením a rozpadem kvartérní struktury bílkovin atp. je řízena velkým počtem slabých nekovalentních vazeb. Tyto rovnováhy jsou většinou velmi křehké a bio-systémy jsou tak vystaveny působení velkého počtu navzájem opačných sil, které se navzájem téměř vyrovnávají. Směr jednotlivých biologických procesů je pak určován malými rozdíly mezi těmito velkými souhrnnými hodnotami. Předkládaná disertační práce se zaměřuje na přesný popis molekulových vlastností, především nekovalentních interakcí, a interpretaci jejich úlohy v rozličných přírodních procesech. První část je zaměřená především na stabilizaci struktury biomolekul (bílkovin), která je studovaná na příkladu komplexu bílkovinného receptoru s ligandem a na příkladu sítě vzájemných interakcí v jádru bílkoviny. Toto je doplněno diskusí obecných důsledků zjištěných skutečností a také nástrah spojených s tímto druhem teoretického popisu. 10 Druhá část je založená na identifikaci struktur (intermediátů a tranzitních stavů) klíčových pro enzymatickou reakci (hydrolýzu peptidové vazby) specifického enzymu a na identifikaci klíčových interakcí důležitých pro jejich stabilizaci. Tato znalost následovně umožnila interpretaci experimentálních mutačních studií prováděných ve spolupracující laboratoři a zároveň zobecňující úvahy o příbuzných enzymech. Závěrem jsou diskutovány obecné teoretické aspekty použitého kvantově chemického popisu. Metody Ve studiích tvořících základ této disertační práce se metodologie skládala především z (i) výběru a přípravy vhodného modelového systému a (ii) z výběru vhodné výpočetní metody. Jako příklad interakce receptoru s ligandem je uveden komplex bílkoviny „pheromone binding protein“ (PBP) s přirozeným feromonem bombykolem ((10E,12Z)-hexadeca-10,12-dien-1-ol). Stabilizace jádra bílkoviny byla pak studována na malé bílkovině rubredoxinu. Teoretické aspekty nekovalentních interakcí, především intramolekulárních, jsou demonstrovány na příkladu [n]helicenů, molekul složených z ortho-kondenzovaných benzenových kruhů. Reakční mechanismus hydrolýzy peptidové vazby byl studován na dizinkové glutamát karboxypeptidáse II (GCPII), zjištěné parametry reakce byly porovnány s výpočty pro hydrolýzu formamidu, hydrolýzu formamidu usnadněnou přítomností molekuly vody (jako obecné báze/kyseliny), hydrolýzu dipeptidu AlaAla a hydrolýzu formamidu v aktivním místě monozinkové peptidásy termolysin. Kvantově chemické výpočty byly provedeny pomocí několika souborů programů. Pro většina výpočtů posloužil program Turbomole. V některých případech byl pro optimalizaci struktury využit program Gaussian. Program Molpro byl použit pro výpočty pomocí metody CCSD(T). Výpočty na principech klasické molekulové mechaniky potřebné pro QM/MM výpočetní proceduru byly provedeny pomocí balíku programů AMBER. 11 Díky tomu, že je enzymová katalýza lokalizována do aktivního místa proteinu, je možné vytvořit kvantově chemický model procesu, který je výpočetně zvládnutelný a zároveň může zahrnout všechny chemické aspekty podstatné pro skutečný proces. Pro modelování okolí aktivního místa pak bylo zvoleno a použito kombinované kvantově a molekulově mechanické (QM/MM) schéma implementované v programu ComQum. Výsledky Byly vypočteny síly interakcí mezi jednotlivými aminokyselinami ve vazebné dutině bílkoviny PBP s feromonem. Párové interakce byly vypočteny na ab initio úrovni (RI-MP2/aug- SVP), přičemž aminokyseliny byly modelovány jako izolované molekuly nebo jejich části. Bylo ukázáno, že molekula feromonu není pouze vytěsněna do vazebné dutiny z vnějšího prostředí (polárního roztoku lymfy v senzile) pro svou hydrofobicitu. Naopak feromon je přitahován několika aromatickými residui uvnitř dutiny (díky X-H…π a π…π interakcím). Bylo ukázáno, že molekula proteinu interaguje prakticky s celou molekulou feromonu včetně jejího nenasyceného uhlovodíkového řetězce. Dále se nám podařilo se vyhodnotit příspěvek hlavních interakcí dvou postranních řetězců fenylalaninu uvnitř proteinu ke stabilizaci bílkoviny. Byly použity výpočty zahrnující velkou část korelační energie (odhad energie na MP2 úrovni v limitní bázi + CCSD(T) korekce) a bylo ukázáno, že stabilizace uvnitř hydrofobního jádra proteinu je překvapivě vysoká. Tato atrakce má podstatu v Londonově disperzní energii a je srovnatelná s klasickými vodíkovými vazbami. Navíc je zřejmé, že aromatické aminokyseliny se mohou účastnit několika silných interakcí najednou, což může být klíčové pro jejich roli centrálních residuí vytvářejících sítě interakcí uvnitř proteinů. Podařilo se ukázat, že intramolekulární superpoziční chyba báze (basis set superposition error; BSSE) může dramaticky ovlivnit vypočtenou energii sbalených, kompaktních systémů molekul a způsobit chybnou teoretickou předpověď geometrií těchto molekul. 12 Na příkladu [n]helicenů bylo ukázáno, že intramolekulární BSSE může být tak veliká že výpočty poskytují zcela absurdní výsledky, jako například vyšší stabilitu [n]helicenu oproti [n]phenacenu pro n > 6 (při použití MP2 a střední až velké sady bázových funkcí, jako je TZVP nebo aug-cc-pVDZ). Naopak bylo ukázáno, že (RI-)DFT-D metoda je mnohem méně zatížená BSSE než MP2, nebo CCSD(T) a že pro optimalizované struktury popisuje disperzní energii správně. Pro katalytickou hydrolýzu peptidové vazby v dipeptidu N- Ac-Asp-Glu pomocí dizinkové metalopeptidásy glutamát karboxypeptidasy II (GCPII) se pomocí výpočetní procedury QM/MM podařilo identifikovat jednu strukturu tetraedrálního intermediátu a dvě struktury odpovídající tranzitním stavům mezi reaktantem (Michaelisův komplex) a tetraedrálním intermediátem na jedné straně a produktem na straně druhé. Vypočtená hodnota aktivační energie byla v uspokojivé shodě s experimentální hodnotou odvozenou z rychlostní konstanty. Jednoduše řečeno, hydrolýza N- Ac-Asp-Glu pomocí GCPII byla popsána jako reakce mezi deaktivovaným hydroxidem a aktivovanou peptidovou vazbou za pomoci glutamátu v roli obecné kyseliny/báze. Fascinující a unikátní role di-zinkového aktivního centra při popisovaném reakčním mechanismu je v tom, že činí nukleofil, tedy OH- anion, dostupným, ale zároveň kontroluje jeho nukleofilicitu. Pokračování reakce je závislé na správné orientaci substrátu a glutamátu 424, která je zajištěna nekovalentními interakcemi s aktivním místem enzymu. Byla kriticky vyhodnocena přesnost několika kvantově chemických výpočetních metod na příkladech hydrolýzy amidů u několika modelových systémů. Pro všechny systémy byla nalezena reakční cesta v plynné fázi a řádně charakterizovány transitní stavy. Bylo ukázáno, že metody (RI-)MP2 a SCS-MP2 popisují systémy s uzavřenými elektronovými slupkami uspokojivě (včetně systémů obsahujících zinečnaté d10 ionty). Nehybridní funkcionály DFT (PBE, TPSS) výšku bariéry podceňují, zatímco hybridní B3LYP výšku bariéry mírně nadhodnocuje. V případě (RI-)DFT-D empirický člen neposkytuje spolehlivou, systematickou korekci rozdílu mezi hodnotami DFT a referencí v podobě CCSD(T) hodnot. 13 Závěry Byla prokázána důležitost disperzní energie pro přesný popis nekovalentních interakcí aromatických residuí. Bylo ukázáno, že interakční energie takovýchto interakcí jsou vůči vodíkovým vazbám srovnatelné a někdy i silnější. Bylo ukázáno, že při modelování větších molekulových systémů musí být postupováno s velkou opatrností. Jeden z fenoménů, který se u menších molekul nevyskytuje, ale může dramaticky ovlivnit popis velkých molekul je intramolekulární bázová superpoziční chyba, basis set superposition error (BSSE). Ukázalo se, že pro struktury v energetickém minimu jsou výsledky metody (RI-)DFT-D minimálně zatížené BSSE a zároveň dávají dobrý popis disperzní interakce. Zároveň bylo ukázáno, že pro popis tranzitního stavu není metoda (RI-)DFT-D vhodná, ani v případě systémů s uzavřenou slupkou. Naopak standardní DFT metody, postrádající správný popis disperze, v těchto případech dávaly přijatelné výsledky. Ve výsledku je patrné, že přesné modelování (simulování) biomolekul v biologických procesech je komplexní problém a není vždy možné a priori vynechat působení vzdálenějších nebo slabě vázaných částí (reziduí). Nicméně, jestliže jsme schopni přesně popsat fyzikální podstatu studovaných jevů, počítačové modelování nám poskytuje cenné informace o studovaných biologických jevech. 14
Abstract v angličtině:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Physical and Macromolecular Chemistry Non-covalent interactions in fundamental biological processes Doctoral Thesis Abstract Mgr. Vojtěch Klusák Supervisor: Mgr. Lubomír Rulíšek, CSc. Institute of Organic Chemistry and Biochemistry AS CR Center for Biomolecules and Complex Molecular Systems Praha 2010 2 Universita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra fyzikální a makromolekulární chemie Nekovalentní interakce v základních biologických procesech Souhrn disertační práce Mgr. Vojtěch Klusák Školitel: Mgr. Lubomír Rulíšek, CSc. Ústav organické chemie a biochemie AV ČR Centrum biomolekul a komplexních molekulárních systémů Praha 2010 3 4 Introduction Understanding inter- and intra-molecular interactions is the key for our insight into the properties of the biomolecular systems which, in turn, maintain and govern virtually all the processes in biology. Attempts to draw the structure-function relationship at the atomistic or electronic level bring us quite often beyond experimental resolution and capabilities. Modern tools of computational chemistry enable us to focus with satisfactory degree of reliability on the details of the studied process, gather additional (often complementary) information and ascribe particular structural features to measurable quantities. Under normal conditions, in the processes related to biomolecular reorganization or assembly (folding or unfolding of protein or nucleic acid complexes or membrane formation), the covalent bonds do not break. Such processes are controlled by non- covalent interactions. Despite individual non-covalent interactions are relatively weak, they are numerous. Large number of small non- covalent forces governs equilibria between folding or unfolding of biomolecules, ligand binding or release, quaternary protein structures assembly or denaturation, and so on. Most of these equilibria are subtle and bio-systems are held in delicate balance between large number of countervailing forces and it is the small difference between these large numbers that determines direction of the process. The presented thesis is focused on accurate description of the molecular properties, especially non-covalent interactions and interpretation of their role in various biological processes. The first part of the thesis is focused on the stabilization of biomolecular (protein) structures, exemplified in a receptor-ligand complex and a network of interactions in the core of the protein. This includes the discussion of the general phenomena resulting from the studied and analyzed characteristics, as well as of some pitfalls related to their theoretical treatment. In the second part of the thesis the key structures (reaction intermediate and transition states) of a prominent enzymatic reaction 5 (peptide hydrolysis) in a specific enzyme and the interactions important for their stabilization have been calculated and analyzed. It allowed us to suggest and discuss mutation experiments carried out in our collaborator’s laboratory and relate the calculated data to the reactions of other hydrolytic enzymes. Finally, the theoretical aspects of the quantum chemical treatment are discussed as well. Methods In the studies collected in this thesis the methodology was focused mainly on (i) selection and preparation of an appropriate model and (ii) selection of an appropriate computational method. An example of receptor-ligand interaction the complex of bombyx mori pheromone binding protein (PBP) with the native pheromone bombykol ((10E,12Z)-hexadeca-10,12-dien-1-ol) is presented. The stabilization of the protein core has been studied on the small protein rubredoxin. Theoretical aspects of the noncovalent interactions, especially the intramolecular ones, are demonstrated on the [n]helicenes, molecules consisting of all-ortho annulated benzene rings. The reaction mechanism of peptide bond hydrolysis has been studied for the dizinc human glutamate carboxypeptidase II (GCPII), and the findings were complemented by calculations of plain formamide hydrolysis, water (as a general acid/base) assisted formamide hydrolysis, AlaAla dipeptide hydrolysis and hydrolysis of formamide in the active site of monozinc peptidase thermolysin. Quantum chemical calculations were performed using several programs. Most of the calculations were performed using Turbomole program. In some cases Gaussian program has been used for the geometry optimization. Molpro has been used for the CCSD(T) calculations. The molecular mechanics calculations included in the QM/MM procedure were performed by the AMBER program package. Localization of the enzyme catalysis in the protein active site makes it possible to construct the appropriate quantum chemical 6 model which is possible to use in quantum chemical calculations and which can reflect all chemically important aspects of the real process. For modeling the effects of the active site environment, the hybrid quantum and molecular mechanical (QM/MM) scheme implemented in the program ComQum has been used. Results Using simple model fragments as representatives of the amino acid residues, the interaction energies of their complexes with pheromone were calculated ab initio (at the level RI-MP2/aug-SVP). It has been shown that the pheromone molecule is not just expelled into the binding cavity from the outer environment (polar sensillar lymph) due to its hydrophobicity. On the contrary, the pheromone is attracted by several aromatic residues in the cavity (via X-H…π and π… π interactions) that interact with practically the whole hydrocarbon unsaturated chain of the pheromone. Next, we have evaluated the stabilization energies provided by the principal interactions of two phenylalanine side chains inside a small protein rubredoxin. We have shown that stabilization inside the hydrophobic core of a small protein, rubredoxin, determined by means of high-level correlated ab initio calculations (complete basis set limit estimate of MP2 stabilization energy + CCSD(T) correction term), is surprisingly strong. This attraction originates in London dispersion energy between aromatic rings or between an aromatic ring and an aliphatic chain, and is comparable to classical H- bonding. Moreover, residues of the aromatic nature can participate in several strong interactions at once, which may be crucial for the role of key residues in establishing networks inside a protein. We have demonstrated that the intramolecular basis set superposition error (BSSE) can dramatically influence the calculated energies of the folded molecular systems and cause predictions of erroneous geometries as well. Namely, in the case of [n]helicenes, it has been shown that the intramolecular BSSE can be so large that the calculations predict clearly absurd results, such as the higher stability of [n]helicene compared with [n]phenacene for n > 6 (using MP2 and 7 medium to large basis sets, such as TZVP or aug-cc-pVDZ). The (RI- )DFT-D method, on the other hand, has been shown much less susceptible to BSSE than MP2 and CCSD(T) and for the energy optimized structures properly accounts for the dispersion energy. Using the QM/MM approach we have identified one reaction intermediate and two corresponding transition states in the glutamate carboxypeptidase reaction cycle. One transition state connects the intermediate with the structure of Michaelis complex (enzyme – substrate complex), and the other transition state leads to the peptide bond cleavage. The agreement with the experimental value of reaction barrier was satisfactory. In simple terms, we proposed to describe the N-Ac-Asp-Glu hydrolysis by GCPII as the reaction between a deactivated hydroxide with an activated peptide bond assisted by glutamate as a general acid/base. The fascinating and unique role of di-zinc center with regard to the reaction mechanism described is in making the nucleophile, the OH- anion, available, but at the same time enabling control of its nucleophilicity. The proceeding of the reaction is depending on proper orientation of the substrate and of the proton shuttle (Glu424) provided by the interactions with the enzyme active site. The accuracy of several quantum chemical methods on the model systems representing important intermediates and transition states in several amide hydrolysis reactions was critically addressed. It was shown that the (RI-)MP2 and SCS-MP2 methods perform reasonably well for the closed shell systems including zinc ions. Non-hybrid DFT functionals (PBE, TPSS) underestimate the barriers whereas the B3LYP exhibits an overestimation of the activation barrier. For the transition state structures the empirical term in case of (RI-)DFT-D does not perform such a reliable and systematic correction of the difference between the results of DFT methods and CCSD(T) benchmark values. 8 Conclusions We demonstrated the importance of dispersion energy for an accurate description of non-covalent interactions of aromatic residues. It has been shown that interaction energies of such interactions are competitive and sometimes can prevail over the hydrogen bonding. It has been shown that an extreme care must be taken when modeling larger molecular systems. One of the phenomena that is not present in the small molecular systems but can dramatically influence the description of larger molecules is the intramolecular basis set superposition error (BSSE). The (RI-)DFT-D method has shown to provide very good results, thus being a practical solution to the intramolecular BSSE problem and at the same time covers the dispersion interaction for the energy optimized structures. However, it was shown that for the description of transition states DFT-D method is not reliable, not even in the case of closed shell systems. On the other hand, the standard DFT methods, lacking proper dispersion description, performed reasonably well in that case. In conclusion, it has been shown that an accurate modeling of biomolecules in biological processes is a complex problem and it is not always possible to a priori neglect the role of more distant or weekly bound components (residues). However, once all the physical aspects of the (bio)chemical processes are well described, computational modeling provides us with the invaluable information about the details of the studied biological phenomena. 9
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Vojtěch Klusák 1.39 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Vojtěch Klusák 5.45 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Vojtěch Klusák 206 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Vojtěch Klusák 128 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Lubomír Rulíšek, Ph.D. 87 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Ing. Jaroslav Burda, DrSc. 84 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Jiří Šponer, DrSc. 1.2 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 209 kB