text size

Cytochrome P-450: Study of structure and interactions using chemical modification, photo-initiated cross-linking and mass spectrometry

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Title:
Cytochrome P-450: Study of structure and interactions using chemical modification, photo-initiated cross-linking and mass spectrometry
Title (in czech):
Cytochrom P-450: studium struktury a interakcí metodami chemické modifikace, foto-iniciovaného síťování a hmotnostní spektrometrie
Type:
Dissertation
Author:
RNDr. Tomáš Ječmen
Supervisor:
doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D.
Opponents:
Doc. RNDr. Jiří Petrák, Ph.D,
prof. Mgr. Marek Šebela, Dr., Ph.D. et Ph.D.
Consultant:
prof. Ing. Vladimír Havlíček, Dr.
Thesis Id:
91764
Faculty:
Faculty of Science (PřF)
Department:
Department of Biochemistry (31-250)
Study programm:
Biochemistry (P1406)
Study branch:
-
Degree granted:
Ph.D.
Defence date:
29/06/2015
Defence result:
Pass
Language:
English
Keywords (in czech):
cytochrom P-450, foto-iniciované síťování, modifikace proteinů, hmotnostní spektrometrie
Keywords:
cytochrome P-450, photo-initiated cross-linking, protein modification, mass spectrometry
Abstract (in czech):
Abstrakt ABSTRAKT Systém oxygenas se smíšenou funkcí se v organismu podílí na biosyntéze endogenních a také metabolismu exogenních látek (např. léčiv nebo chemických prokarcinogenů). Substráty jsou biotransformovány terminálními oxygenasami systému – cytochromy P450 (P450). Katalytické vlastnosti některých jejich zástupců (např. studované izoformy 2B4) jsou pozměněny v přítomnosti redoxního partnera – cytochromu b5 (cyb5). Oba cytochromy jsou ukotveny hydrofobními doménami v lipidické membráně endoplasmatického retikula, zatímco jejich katalytické domény jsou exponovány do cytosolu buňky. K rozšíření současných znalostí o struktuře a interakcích studovaných cytochromů byly využity dva přístupy založené na kovalentním síťování aminokyselin v „nulové vzdálenosti“ (angl. „zero-length cross-linking“): (1) chemické síťování činidlem 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) propojujícím ve vodném prostředí přístupné karboxylové skupiny s primárními aminy, a (2) síťování pomocí foto-labilního analogu methioninu (pMet), který se po aktivaci UV zářením může vázat na libovolnou aminokyselinu, a to v hydrofobním i hydrofilním prostředí. pMet byl do sekvence cyb5 inkorporován namísto methioninu během rekombinantní exprese proteinu v E. coli, která probíhala v limitním médiu obohaceném o aminokyselinový analog. Optimalizací experimentálních podmínek bylo dosaženo přibližně 20-30% substituce přirozené aminokyseliny. Zesítěné heteromery byly separovány na 1-dimenzionální elektroforéze, a komplexy o nejednoznačně určené stechiometrii byly charakterizovány pomocí 2-dimenzionální elektroforézy a metodou celkové aminokyselinové analýzy. Ve směsi získané proteolýzou jednotlivých oligomerů P450 2B4:cyb5 (1:1, 1:2 nebo 2:1) byly zesítěné peptidy identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením ve spojení s kapalinovou chromatografií. Foto-síťování vůbec poprvé přímo potvrdilo interakci hydrofobních helixů cyb5 a P450 2B4 v prostředí lipidické membrány, a ukázalo také doposud nepopsané kontaktní oblasti obou proteinů v cytosolu. Další aminokyselinové páry podílející se na kontaktu katalytických domén byly zachyceny pomocí činidla EDC, a výsledky byly využity při in silico modelování této interakce. Prezentovaná zjištění podporují obecně přijímanou topologii obou cytochromů při níž dochází k přenosu elektronu. Navíc však naznačují další možné natočení proteinů, které je pro přenos elektronu nevhodné, může však být zodpovědné za alosterickou modulaci P450 2B4. Existenci minimálně dvou orientací potvrzuje i vznik heterotrimerních komplexů se stechiometrií cytochromů 1:2 a 2:1. Výsledky demonstrují výhody nově vyvinutého foto-iniciovaného síťování pro studium transientních protein-proteinových interakcí oproti síťování chemickému: (1) vazba pMet na jakoukoliv aminokyselinu v blízkosti (2) nezávisle na okolním prostředí (membrána, cytosol), (3) úspěšné zavedení foto-aktivovatelné aminonyseliny na požadovaná místa sekvence proteinu pomocí místně cílené mutageneze, a (4) vysoká rychlost reakce vzniklých biradikálů, které zachycují okamžité uspořádání systému, včetně více souběžně interagujících proteinů.
Abstract:
Abstract ABSTRACT Mixed function oxygenase system participates in biosynthesis of endogenous and metabolism of exogenous substances (e.g. drugs or chemical procarcinogens) in an organism. Substrates are biotransformed by terminal oxygenases – cytochromes P450 (P450). Catalytic properties of certain P450s (e.g. studied isoform 2B4) are altered in the presence of a redox partner – cytochrome b5 (cyb5). Both cytochromes are anchored by hydrophobic domains in a lipid membrane of endoplasmic reticulum whereas their catalytic domains are exposed to cytosol. Two zero-length cross-linking approaches were employed to extend present knowledge of P450 2B4 and cyb5 protein structure and protein-protein interactions: (1) interlinking of carboxylate and primary amine groups of amino acids by water soluble 1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), and (2) photo-initiated cross-linking by photo-labile methionine analog (pMet), which links to any amino acid after activation by UV-irradiation, either in hydrophilic or hydrophobic environment. pMet was incorporated to methionine site(s) of cyb5 during recombinant expression in E. coli, which was carried out in limit medium supplemented with amino acid analog. Optimization of experimental conditions led to ~20-30% substitution of the natural amino acid. Covalent complexes of various stoichiometries arisen from cross-linking were separated by 1-dimensional electrophoresis, but the molecular weigth and consequently the protein ratio of the heteromers had not been deduced conclusively. Therefore 2- dimensional electrophoresis and total amino acid analysis were employed to determine P450 2B4:cyb5 ratios (1:1, 1:2 or 2:1). Individual assemblies were proteolytically digested and the cross-links were identified in the resulting peptide mixture by high resolution mass spectrometry coupled to liquid chromatography. Photo-initiated cross-linking directly identified interaction of cyb5 and P450 2B4 hydrophobic helices in the lipid membrane environment for the first time, and also revealed yet unknown contact regions of both proteins in cytosol. More amino acids of the catalytic domains were fixated by EDC agent, and the acquired data served as a basis for in silico modeling of this interaction. Presented findings support generally adopted topology of the cytochromes, which is suitable for electron transfer. Additionally, they also indicate distinct protein orientation, which is improper for the electron donation, however could be responsible for allosteric modulation of P450 2B4. Also the formation of heterotrimeric complexes with cytochrome stoichiometries 1:2 and 2:1 validates the existence of at least two mutual protein orientations. The results demonstrate advantages of novel photo-induced cross-linking in comparison to conventional chemical cross-linking for transient protein-protein interactions determination: (1) the binding of pMet to any amino acid side chain in its close proximity (2) independently on surrounding environment (cytosol, lipid membrane), (3) successful introduction of photo-reactive amino acid analogue to the requested sites in the sequence by site directed mutagenesis, and (4) the rapid reaction of carbene biradicals capturing momentary organization of the system, including more concurrently interacting proteins.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis RNDr. Tomáš Ječmen 6.05 MB
Download Attachment to the thesis RNDr. Tomáš Ječmen 1.93 MB
Download Abstract in czech RNDr. Tomáš Ječmen 154 kB
Download Abstract in english RNDr. Tomáš Ječmen 154 kB
Download Autoreferat / doctoral thesis summary RNDr. Tomáš Ječmen 4.4 MB
Download Opponent's review Doc. RNDr. Jiří Petrák, Ph.D, 248 kB
Download Opponent's review prof. Mgr. Marek Šebela, Dr., Ph.D. et Ph.D. 266 kB
Download Defence's report 1010 kB