velikost textu

HIV - 1 Protease: Insights into Drug Resistance Development

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
HIV - 1 Protease: Insights into Drug Resistance Development
Název v češtině:
HIV-1 proteáza: náhled do vývoje virové rezistence
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Klára Grantz Šašková, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Jitka Forstová, CSc.
Ing. Jan Dohnálek, Ph.D.
Celia Schiffer, Ph.D.
Id práce:
91761
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
18. 6. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Abstrakt Aminokyselinové záměny v HIV proteáze či jejím substrátu, které snižují citlivost k proteázovým inhibitorům, představují celkem složitý problém, který není jasně charakterizován. Četné mechanismy, jakými mnohdy velmi komplikovaná skladba mutací ovlivňuje vazbu inhibitoru, musí nutně být analyzovány na molekulární úrovni, a to nejlépe sérií metod, počínaje experimenty s rekombinantními viry, enzymovými esejemi, strukturálními a termodynamickými studiemi či molekulární dynamikou. Každý výsledek pak může pomoci sestavit dohromady jakousi mozaiku evoluce vzniku rezistence k proteázovým inhibitorům, a tím se nepřímo podílet na vývoji ještě účinnějších léků tzv. třetí generace cílených proti HIV/AIDS. Tato dizertační práce představuje několik analýz zabývajících se vznikem rezistence u HIV viru právě na molekulární úrovni. Zaměřili jsme se konkrétně na evoluční dráhu vedoucí k rezistenci k proteázovému inhibitoru nelfinaviru, dále na tzv. lopinavirové mutační skóre, poté na výskyt aminokyselinových inzercí v genu HIV proteázy a jejich vliv na rezistenci k proteázovým inhibitorům a v neposlední řadě jsme analyzovali vysoce mutované varianty HIV proteázy izolované z pacientů, u kterých již nebyla účinná terapie darunavirem. Jelikož jsme byli schopni pracovat s širokou škálou technik, podařilo se nám objasnit a poskládat alespoň některé střípky týkající se evoluce viru, zejména pak posledního kroku životního cyklu HIV, a tím přinést cenné poznatky nutné k vývoji nových originálních léčiv. Cíle projektu Všechny čtyři cíle práce měly jedno společné: prozkoumat různé mechanismy vedoucí ke vzniku rezistence k inhibitorům HIV proteázy. Prvním úkolem jsme si zvolili analyzovat evoluční dráhu vedoucí ke vzniku rezistence k proteázovému inhibitoru nelfinaviru a objasnit jednotlivé role tzv. kompenzačních mutací ve smyslu in vitro kinetických studií, strukturálních a termodynamických analýz a molekulové dynamiky. Druhým cílem bylo objasnit význam tzv. lopinavirového mutačního skóre, konkrétně vliv mutace I47A samotné a na pozadí dalších mutací vyskytujících se v proteáze izolované z pacienta; a dále pak objasnit roli doprovodných mutací na molekulární úrovni. Naším třetím úkolem pak bylo prozkoumat pravděpodobně zcela nový mechanismus vzniku rezistence, který představují aminokyselinové inzerce v proteáze. Cílem bylo analyzovat proteázy odvozené z pacientů, které obsahovaly jednu aminokyselinovou inzerci v pozicích 33 či 35 a opět je charakterizovat pomocí in vitro enzymových kinetických studií, krystalových struktur a replikačních kapacit příslušných rekombinantních virů. Poslední úkol v sobě zahrnoval proteázy izolované z pacientů necitlivých na terapii darunavirem, které v sobě nesly značný počet tzv. rezistentních mutací. Naším záměrem bylo prostudovat parametry vedoucí k necitlivosti na darunavir ve smyslu enzymové kinetiky, strukturní analýzy a termodynamických charakteristik. Shrnutí V první publikaci této dizertační práce jsme se zaměřili na dvě evoluční dráhy vedoucí k rezistenci k nelfinaviru zahrnující mutace D30N a L90M. Dále jsme zkoumali efekt kompenzačních mutací, vše pomocí in vitro kinetických enzymových studií, termodynamické a strukturální analýzy a molekulové dynamiky. Vedle mnohého jsme se naučili, že pouze díky kombinaci nejrůznějších molekulárních technik jsme schopni plně analyzovat daný problém. Druhou publikací jsme zamířili do problematiky vývoje lopinavirové rezistence. Lopinavir, jakožto proteázový inhibitor druhé generace, byl navržen k inhibici již rezistentních variant viru a je široce používán s velmi dobrými výsledky. Porozumění jeho rezistentnímu profilu bylo pro nás skutečnou výzvou. Popsali jsme strukturní změny vznikající díky mutaci I47A uměle zanesené na pozadí kombinace mutací izolovaných z pacienta a vysvětlili jsme jejich jednotlivé vlivy pomocí vypočtených energií z molekulové dynamiky. Práce shrnutá ve třetí publikaci byla pro nás doslova „třešničkou na dortu“. Zaměřili jsme se na problematiku aminokyselinových inzercí v HIV proteáze ve smyslu enzymových kinetických měření, replikace příslušných virů a strukturní analýzy. Dokonce jsme byli první, komu se podařilo vyřešit strukturu HIV-1 proteázy obsahující inzerci. Ukázali jsme, že tyto inzerce v proteáze mohou představovat zcela nový ojedinělý mechanismus vývoje rezistence k proteázovým inhibitorům. Nakonec data publikovaná v posledním, čtvrtém článku, opět potvrdila, že čím lepší proteázový inhibitor, tím složitější je jeho rezistentní profil. Darunavir představuje inhibitor s vysokou genetickou bariérou ke vzniku rezistence a vyžaduje tak kombinaci značného množství mutací k podstatnému snížení citlivosti. Zaměřili jsme se na jeho tzv. mutační skóre, opět jakýsi souhrn mutací odpovědný za vznik rezistence tím, že jsme zanalyzovali proteázy odvozené z několika pacientů, které obsahovaly doslova rekordní počet mutací. Připravili jsme je nejen v dostačující kvantitě a kvalitě pro proteinovou krystalizaci, ale také se nám podařilo vykrystalovat a vyřešit strukturu dvou komplexů proteázy s darunavirem, na kterých jsme ukázali strukturní změny, které jsou s největší pravděpodobností odpovědné za vznik rezistence. Obrázek 1: Pozice mutací ve dvou proteázových variantách v naší studii zabývající se rezistencí na darunavir.
Abstract v angličtině:
Abstract Amino acid changes within HIV protease or its substrate that decrease the susceptibility to protease inhibitors represent a highly complex issue still not yet fully understood. Various mechanisms by which this often complicated pattern of mutations influence drug binding needs to be analyzed on a molecular level by a series of methods including experiments with recombinant viruses, biochemical enzyme analysis, structural and thermodynamical studies or molecular dynamics. Each result may help to complete the overall picture of protease inhibitor resistance evolution and therefore contribute to the design of more powerful 3rd generation HIV/AIDS drugs. This thesis presents several analyses of HIV resistance development on molecular level. We have focused on the nelfinavir resistance pathway, lopinavir mutation score, emergence of amino acid insertions in HIV protease gene and their contribution to protease inhibitor resistance and finally we analyzed a highly mutated protease species isolated from patients failing darunavir therapy. Since we are able to accomplish a wide combination of techniques, we could explain and put together some pieces of viral evolution considering the final steps of HIV life cycle and also provide knowledge necessary for novel inhibitor design. Aims of the Project There were four major aims of the project that all had one goal in common: to investigate different mechanisms leading to resistance development to HIV protease inhibitors. The first aim was to analyze evolutionary pathways leading to resistance towards protease inhibitor nelfinavir and to inspect the role of compensatory mutations in terms of in vitro kinetics, structural and thermodynamical analyses and computational dynamics. Secondly, we aimed to inspect lopinavir mutation score, specifically the mutation I47A in and out of the background of other mutations isolated from a patient; and to find synergistic accompanying substitutions and analyze them on the molecular level. The third aim was to explore a possible novel mechanism of resistance development by incorporating amino acid insertions into the protease. Our goal was to analyze patient-derived proteases with one amino acid insertion at position 33 and 35 in terms of in vitro kinetics and crystal structures and to analyze PR susceptibility and replicative capacity of corresponding viruses in vitro. The last aim involved proteases carrying multiple drug-resistant mutations isolated from the patients failing darunavir therapy. Our intention was to investigate the parameters driving to resistance towards darunavir in terms of enzyme kinetics, structural analyses and thermodynamical characteristics. Conclusions In the first published paper of this thesis we focused on two different pathways driving nelfinavir resistance along D30N and L90M substitutions. We also investigated various effects of compensatory mutations, all by means of in vitro kinetic measurement, thermodynamical analysis, X-ray structures and molecular dynamics. We learned, apart from many specific results, that only the combination of several molecular techniques can help to fully analyze the problem. Second paper guided us into lopinavir resistance evolution. Lopinavir, as a second generation inhibitor designed to inhibit resistant viral species, is widely used with very good results. Understanding its complex resistance profile was a major challenge for us. We described structural changes resulting from introducing I47A mutation into the backround of patient-derived substitutions and explained them also with the help of energy calculations. The project summarized in the third paper was a truly "cherry on top" for us. We looked closely into the problem of amino acid insertions, investigated them in terms of enzyme kinetics, viral replication and structural analysis and we happened to be the first who solved the structure of HIV-1 protease with an insertion. We also showed that insertions in the protease gene might represent completely novel mechanism of resistance development to protease inhibitors. Finally, the data published in the fourth paper again proved that the better the inhibitor the more complicated its resistance profile is. Darunavir is a protease inhibitor with high genetic barrier to resistance development and requires accumulation of considerable number of mutations for the resistance to occur. We closely looked into darunavir mutation score, a set of PR mutations responsible for the viral resistance to darunavir, by analyzing patient-derived proteases harboring record-breaking number of mutations. We were not only able to produce them is sufficient amount and purity for crystallization experiments, but also we succeeded in crystallizing two of those in complex with darunavir and show the structural differences causing the resistance. Figure 1: Positions of the mutations in protease variants used for structural studies concerning darunavir resistant variants. 3
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Klára Grantz Šašková, Ph.D. 77.33 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Klára Grantz Šašková, Ph.D. 66 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Klára Grantz Šašková, Ph.D. 53 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jitka Forstová, CSc. 152 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Jan Dohnálek, Ph.D. 89 kB
Stáhnout Posudek oponenta Celia Schiffer, Ph.D. 222 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 624 kB