velikost textu

Overcoming drug resistance: The discovery, design and characterization of new nonpeptidic inhibitors of HIV - 1 protease

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Overcoming drug resistance: The discovery, design and characterization of new nonpeptidic inhibitors of HIV - 1 protease
Název v češtině:
Objev, návrh a charakterizace nových nepeptidových inhibitorů HIV-1 proteázy
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Milan Kožíšek
Školitel:
doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc.
Oponenti:
Dr. Pavel Majer
doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D.
Id práce:
91760
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
18. 6. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Doktorská dizertační práce – abstrakt Objev, návrh a charakterizace nových nepeptidových inhibitorů HIV-1 proteázy RNDr. Milan Kožíšek Školitel : Doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc. Katedra biochemie Přírodovědecká fakulta Karlova univerzita, Praha, Česká republika Ústav organické chemie a biochemie Gilead Sciences & IOCB Research Centre Akademie věd České republiky Praha 2010 Abstrakt HIV-1 proteáza je aspártátová proteáza, jejíž aktivita je nezbytná v životním cyklu viru HIV. Je odpovědná za štěpení virových polyproteinů na strukturní proteiny a enzymy během zrání viru. Inhibice tohoto enzymu vede k tvorbě nezralých a tedy neinfekčních virových částic. Uvedení proteázových inhibitorů na trh dramaticky změnilo úspěch léčby retrovirové infekce. Množství viru v krevní plazmě pokleslo pod zjistitelnou úroveň a vývoj nemoci se výrazně zpomalil. Nicméně se začala vyvíjet rezistence k inhibitorům. První proteázové inhibitory vykazovaly nízkou biodostupnost, měly řadu nežádoucích účinků a snadno k nim byla vyvíjena rezistence. Aby se předešlo těmto nežádoucím jevům, byly a jsou stále vyvíjeny inhibitory druhé generace. Pochopení mechanismu, kterým rezistence vůči určitému inhibitoru vzniká, je velmi důležité při vývoji nových antiretrovirotik i při klinické léčbě. Kvůli vznikající rezistenci je stále nutné nalézat nové nepeptidové inhibitory s jedinečným rezistentním profilem, jiným způsobem účinku a ojedinělým chemickým složením. Tato doktorská práce přináší pohled do vývoje rozdílných tříd neobvyklých proteázových inhibitorů. Objasňuje vývoj rezistence vůči proteazovému inhibitoru nelfinaviru. Hlavní část práce je však zaměřena na vývoj a charakterizaci metalokarboranů, nových nepeptidových inhibitorů HIV-1 proteázy, které představují slibné farmakofory s léčebným potenciálem. Cíle dizertační práce Prvním cílem této práce bylo připravit a enzymologicky, strukturálně a termodynamicky charakterizovat rekombinantní HIV-1 proteázy s mutacemi odpovědnými za rezistenci vůči inhibitoru nelfinaviru. Hlavním smyslem bylo pochopit, jak jednotlivé mutace přispívají k vazbě nelfinaviru do enzymu a jak dodatečné mutace ovlivňují jejich efekt. Pochopení vlivu jednotlivých mutací na vazbu nelfinaviru je důležitou informací pro vývoj nových a lepších inhibitorů HIV-1 proteázy. Během náhodného testování různých anorganických a organických sloučenin jsme zjistili, že metalokarborany jsou slibnými inhibitory HIV-1 proteázy. Druhým cílem práce bylo tuto skupinu látek enzymologicky charakterizovat, zjistit jejich inhibiční schopnost vůči proteáze, u vybraných metalokarboranů určit jejich specifitu a zda jsou schopny inhibovat i multirezistentní HIV-1 proteázy. 3 Výsledky práce V této práci jsem objasnil mechanismus vzniku rezistence vůči nelfinaviru, proteázovému inhibitoru první generace. Díky spolupráci s laboratoří Dr.Mammana v rámci pátého rámcového programu Evropské unie jsem připravil řadu HIV-1 proteáz obsahujících mutace snižující sílu vazby nelfinaviru do proteázy a tedy zvyšující rezistenci enzymu k tomuto inhibitoru. Typickou mutací způsobující rezistenci k nelfinaviru je mutace D30N. Dříve se věřilo, že proteáza nesoucí tuto mutaci ztrácí důležitou vodíkovou vazbu k hydroxylové skupině nelfinaviru. Strukturní a termodynamickou analýzou jsme zjistili, že tato vazba je zachována, ale oslabena. Kinetická analýza ukázala, že největší vliv na rezistenci vůči nelfinaviru z testovanýh proteáz má proteáza s mutacemi D30N a N88D, kombinací často se vyskytující u pacientů léčených nelfinavirem a u kterých terapie tímto inhibitorem selhala. Hlavní rozdíl ve vazbě byl zjištěn a vysvětlen odlišným vazebným modem řízeným molekulami vody. Termodynamická analýza odhalila nepříznivý vliv těchto mutací na entalpický i entropický příspěvek vazby. Všechny tyto analýzy byly provedeny i pro ostatní mutantní proteázy. Metoda molekulového modelování pomohla vysvětlit všechna zjištěná data a ukázala, že entropie vazby hraje podstatnou roli při vzniku rezistence k nelfinaviru. Před sedmi lety jsme během náhodného testování stovek anorganických a organických sloučenin objevili metalokarborany jako slibné inhibitory HIV-1 proteázy. Nejprve jsme s užitím enzymové eseje metalokarborany charakterizovali a získali parametry jejich inhibičních schopností. Nalezli jsme určitý vztah mezi inhibiční aktivitou a strukturními rysy inhibitoru. Některé metalokarborany byly určeny jako nanomolární nepeptidové inhibitory HIV-1 proteázy. Doktorka Pavlína Řezáčová určila strukuru komplexu HIV-1 proteázy se základním metalokarboranem GB-18 a tím i jeho vazebný mód. Tato struktura byla vůbec první zjištěnou strukturou komplexu protein-karboran, která kdy byla vyřešena. a) b) Obrázek č.1 (a) Chemický vzorec základního metalokarboranu GB-18. BH skupiny jsou znázorněny oranžovými kuličkami, CH skupiny černými kuličkami a ion kobaltu reprezentuje modrá středová koule. (b) Struktura komplexu HIV-1 proteázy s dvěma molekulami metalokarboranu GB-18, získána rentgenostrukturní analýzou v laboratoři Dr. Řezáčové na ÚOCHB AV ČR. 4 Dále jsme zjistili, že metalokarborany inhibují slaběji i HIV-2 proteázu a proteázu z myšího endogenního retroviru MIA14. Velmi slabě též inhibují další aspartátové proteázy pepsin a katepsin D. U ostatních typů proteáz inhibiční schopnost nebyla prokázána. Během vývoje inhibitorů druhé generace je nezbytné, aby měly schopnost inhibovat multirezistentní proteázy vyvinuté při léčbě předešlými inhibitory. Ukázalo se, že metalokarborany jsou inhibitory HIV-1 proteázy s jedinečným rezistentním profilem. Dokázaly efektivně inhibovat proteázy odvozené od pacientů, u kterých léčba řadou inhibitorů selhala. Po mnoha neúspěšných pokusech se podařilo Dr.Řezáčové objasnit také strukturu komplexu proteázy s nanomolárním metalokarboranem GB-80. a) b) PR1 D30N/N88D PR2 M46I/A71V/V82T/I84V PR3 A71V/V82T/I84V PR4 V32I/I47A L10I/I15V/E35D/N37S/R41K/I62V/ PR5 L63P/A71V/G73S/L90M L10I/L24I/L33F/M46L/I54V/L63P/ PR6 A71V/V82A/I84V L10F/L19I/K20R/L33F/E35D/M36I/ PR7 R41K/F53L/I54V/L63P/H69K/A71V/ T74P/I84V/L89M/L90M/I93L Obrázek č.2 (a) Seznam použitých HIV-1 proteáz pro testování rezistenčních profilů vybraných metalokarboranů. (b) Graf vitalit (měr in vitro rezistence) pro sedm klinicky užívaných inhibitorů a čtyři metalokarborany a sedm rezistentních proteáz. Chemické vzorce těchto čtyř metalokarboranů jsou uvedeny vedle grafu. 5
Abstract v angličtině:
Ph.D. thesis abstract Overcoming drug resistance : The discovery, design and characterization of new nonpeptidic inhibitors of HIV-1 protease Milan Kožíšek, M.Sc. Supervisor : Jan Konvalinka, Ph.D. Department of Biochemistry Faculty of Science Charles University, Prague, Czech Republic Institute of Organic Chemistry and Biochemistry Gilead Sciences & IOCB Research Centre Academy of Sciences of the Czech Republic Prague 2010 Abstract HIV-1 protease is an aspartic protease which plays an essential role in the life cycle of HIV virus. It is responsible for the cleavage of the viral polyproteins into the structural and functional proteins during viral maturation. The efficient inhibition of the protease thus leads to the formation of immature and non-infectious viral particles. The introduction of protease inhibitors dramatically changed the treatment of retroviral infection. The viral replication was reduced to undetectable level and the rate of disease progression was significantly lowered. However, resistance to the inhibitors was observed. The first inhibitors had limited bioavailability, caused severe side effects and easily developed resistance. To combat these negative factors, second-generation inhibitors have been developed. Understanding the mechanisms of resistance toward inhibitors is critical for the optimal use of antiretrovirotics in clinical practice. There is still need for new nonpeptidomimetic inhibitors with unique resistance profiles, different modes of action and novel structures. This thesis gives an overview of the development of different classes of new, unusual protease inhibitors. In addition, it presents data on the resistance development during antiretroviral treatment with a protease inhibitor called nelfinavir. The main part of the thesis is devoted to the design and characterization of metallacarboranes, novel nonpeptidic HIV protease inhibitors that represent attractive pharmacophores with therapeutic potential. The aims of the thesis The first aim of the thesis was to prepare, enzymologically, structurally and thermodynamically characterize recombinant HIV-1 proteases bearing mutations responsible for the resistance to nelfinavir. The main purpose of this project was to understand how single mutations contribute to the affinity of protease to nelfinavir and how the additional mutations can modulate their effect. The understanding of the effects of individual mutations on inhibitor binding determined by enzymological assay, X-ray crystallography, and isothermal titration calorimetry is important for the design of next generation HIV protease inhibitors. During random testing of different inorganic and organic compounds, we identified metallacarboranes as promising inhibitors of HIV-1 protease. The second aim of the thesis was to determine inhibition characteristics, selectivity, specificity, and resistance profile of novel non-peptidic HIV protease inhibitors containing metallacarborane clusters. 3 Conclusions In this thesis, I analyzed the mechanisms of resistance toward one first generation inhibitor nelfinavir. In cooperation with the laboratory of Dr. Mammano within the 5th EU framework, I prepared HIV-1 proteases bearing the single mutations D30N, L90M, N88D and A71V and their combinations, which were identified as main contributors in resistance development to nelfinavir. Many scientific groups imputed the affect of D30N mutation on resistance to the loss of hydrogen bonding between asparagine at position 30 and the hydroxyl group of nelfinavir. Using structural and thermodynamical analysis, we found that although this bond is slightly weakened, it is still maintained. The kinetic analysis showed high level of resistance for mutant D30N/N88D that is a rather frequent combination found in patients. The main difference in the binding of nelfinavir to the active site of this protease variant was identified and explained by distinct contact between mutated residues mediated by water molecules. Thermodynamical analysis revealed unfavorable change both in enthalpic and in entropic contribution. Similar analyses were carried out for other mutant proteases as well. Molecular analysis finally allowed to interpret the experimental data and showed that the entropy of the binding play significant role in the development of nelfinavir resistance. Seven years ago, during random testing of hundreds of inorganic and organic compounds for their possibility to inhibit HV-1 protease, we identified metallacarboranes as potent inhibitors of the enzyme. First, we aimed to characterize them by enzymological essay to determine the binding characteristics. We found some structure activity relationship and identified metallacarboranes as nanomolar non- peptide inhibitors of HIV protease. Further, the structure of parental metallacarborane bound to the wild-type HIV-1 protease was determined which allowed us to identify the binding mode of these inorganic compounds into the active site of the enzyme. This was the first 3-D structure of a carborane- protein complex ever solved. a) b) Figure 1. (a) Chemical formula of parental metallacarborane GB-18. BH groups are depicted as orange balls, CH groups as black balls, and cobalt ion as blue ball. (b) The crystal structure of the HIV-1 protease: GB-18 complex. Two molecules of GB-18 are represented by sphere model and called as Cb1 and Cb2. The structure was solved in the laboratory of Dr. Řezáčová from IOCB AS CR. 4 We knew from the history of the development of other inhibitors how important their specificity towards their target was. We decided to test it and found out that metallacarboranes inhibit also homologous protease from HIV-2 virus and another retroviral protease from endogenous virus MIA14, but less tightly. They weakly inhibit other tested aspartic proteases (pepsin and cathepsin D) and did not inhibit other enzymes analyzed. The important requirement, especially during development of second generation HIV-1 protease inhibitors, is the inhibition effectivity against multi-drug resistant strains. Tested metallacarboranes kept their potency and were effective inhibitors of various resistant proteases even derived from patients with a long treatment history, in which the antiretroviral therapy failed. We invested much effort to the structural analysis of these compounds. After many unsuccessful attempts to get the crystal, Dr. Řezáčová luckily solved the structure of an inhibitor containing two metallacarborane clusters exhibiting low nanomolar inhibition potency. The strategy of the connection of two clusters with amino group containing linker resulted in the formation of the most effective inhibitors. However, the position of the linker was not visible in the map of electron densities due to its high flexibility. Molecular modeling and calculations were used to predict possible linker conformers. a) b) PR1 D30N/N88D PR2 M46I/A71V/V82T/I84V PR3 A71V/V82T/I84V PR4 V32I/I47A L10I/I15V/E35D/N37S/R41K/I62V/ PR5 L63P/A71V/G73S/L90M L10I/L24I/L33F/M46L/I54V/L63P/ PR6 A71V/V82A/I84V L10F/L19I/K20R/L33F/E35D/M36I/ PR7 R41K/F53L/I54V/L63P/H69K/A71V/ T74P/I84V/L89M/L90M/I93L Figure 2. (a) The list of mutations of recombinant HIV-1 proteases used in study. (b) Vitalities of seven clinically used protease inhibitors and metallacarboranes with the panel of protease mutants. Chemical formulas of metallacarboranes are shown. 5
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Milan Kožíšek 73.88 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Milan Kožíšek 283 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Milan Kožíšek 273 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Pavel Majer, CSc. 344 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. 89 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 651 kB