velikost textu

Panels of steroid receptor reporter cell lines for compound profiling and development of selective ligands for estrogen receptor alpha and beta

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Panels of steroid receptor reporter cell lines for compound profiling and development of selective ligands for estrogen receptor alpha and beta
Název v češtině:
Panely reportérových linií pro steroidní receptory určené k profilování chemických knihoven a vývoj selektivních ligandů pro estrogenové receptory alfa a beta
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. David Sedlák, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Petr Bartůněk, CSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Pavel Anzenbacher, DrSc.
RNDr. Alexander Kasal, DrSc.
Id práce:
91758
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
13. 9. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Obr 1. Porovnání odpovědí U2OS-ERα/3xERE (●), U2OS-ERαwt-LBD/9xGal4UAS (○) a U2OS- ERαG420C-LBD/9xGal4UAS ( ) z reportérových buněčných linií vystavených vzrůstající koncentraci vybraných látek. Agonistická odpověď reportérových buněčných linií v závislosti na E2 (A), DES (B) a PPT (C) je vyjádřena jako podíl naměřené luciferázové aktivity vyvolané testovanou látkou a luciferázovou aktivitou naměřenou maximální stimulací receptoru pomocí E2. V antagonistickém modu byly buňky inkubovány s různými koncentracemi ICI 182.780 (D), raloxifene hydrochloridu (E) and tamoxifen citrátu (F). Panel reportérových linií využívajících plnodélkových steroidních receptorů je zvláště vhodný pro detailní studium mechanizmů jakými látky dosahují biologických projevů vazbou na steroidní receptory. Tento systém totiž poskytuje biologicky více významnou informaci o aktivitě testované látky tím, že odráží například aktivitu jiných transkripčních faktorů, signálních drah, přítomnost různých kofaktorů v buňce atd. Užitečnost těchto buněčných linií jsme prokázali „screeningem“ chemické knihovny obsahující 3700 látek a identifikací nových agonistů a antagonistů pro PR, MR a GR. A B Obr 3. Účinek E2 na růst myší mléčné žlázy u mladých myších samic. Prepubertálním mladým myším bylo po dobu 10 dnů podáváno subkutánně pouze olejové vehikulum (kontrola) (A) nebo E2 v dávce 1μg/den rozpuštěný v olejovém vehikulu (B). Po skončení experimentu byly mléčné žlázy vypreparovány, fixovány, odtučněny a obarveny hematoxylinem. E2 PN214 400 Normalized uterine wet weight [%] 350 300 250 200 150 100 50 0 Control 0.001 0.01 0.1 1 10 Dose [ug/animal and day] Obr 2. Estrogenicita PN214 a E2 in vivo. Prepubertálním mladým myším bylo po dobu 10 dnů podáváno subkutánně pouze olejové vehikulum (control) nebo různé dávky E2 nebo PN214. Po této době byly myši zváženy a utraceny. Dělohy byly vyjmuty a zváženy. Jejich váha byla normalizována na hmotnost celé myši a je zobrazena jako procentuální poměr vůči průměrné hmotnosti děloh kontrolních myší. Data jsou uvedena jako průměr hodnot ± SD ze 7 myší v každé skupině. Druhá část této práce je zaměřena na studium vztahu aktivity a struktury různých 17α-substituovaných estradiolů na estrogenových receptorech. Prokázali jsme, že je možné pečlivým výběrem substituentů v 17α pozici na E2 vytvořit nové ligandy s pozoruhodnou selektivitou jednak k ERα ale také k ERβ. Tato možnost je elegantní v tom smyslu, že předchozí úspěšné snahy o vytvoření selektivních ligandů uspěly, pokud byly zaměřené na různá místa ve steroidní kostře. Bohužel modifikace substituentů na jedné a té samé pozici umožnily vždy pouze přesmyk agonistické aktivity do antagonistické a naopak anebo pouze jemnou úpravu již dosažených vlastností. Byla připravena série 17α-perfluoroalkylestradiolů jako selektivních ligandů pro ERα a série 17α- arylestradiolů obsahující selektivní ligandy pro ERβ. Jejich vlastnosti byly studovány pomocí rozmanitých in vitro metod jako například afinitními vazebnými esejemi s rekombinantními estrogenovými receptory založenými na polarizované fluorescenci, luciferázovými buněčnými reportérovými esejemi a estrogenní proliferační esejí s MCF-7 buněčnou linií odvozenou z karcinomu prsu. Dále bylo provedeno in vivo testování estrogenicity selektivního ligandu pro ERβ v estrogenní bioeseji na růstu mléčných žláz a děloh u mladých myších samic. Obě tyto třídy nových ligandů umožňují oddělení aktivit jednoho estrogenového receptoru od druhého, a protože jsou přirozené estrogeny neselektivní, představují cenné nástroje pro výzkum těchto receptorů a potenciálně významné látky s terapeutickým účinkem.
Abstract v angličtině:
Summary of the Ph.D. thesis Steroid hormone receptors represent a major target in the drug discovery. As ligand inducible transcription factors, their activity can be modulated by small lipophilic molecules. The first part of this work describes a preparation of two panels of potent, selective and robust luciferase reporter cell lines on the unified cellular background in U2OS osteosarcoma cell line. This system consists of two panels of stable luciferase reporter cell lines for estrogen receptor α (ERα), estrogen receptor β (ERβ), androgen receptor (AR), glucocorticoid receptor (GR), mineralocorticoid receptor (MR) and progesterone receptor (PR). The first panel of reporter cell lines relies on the expression of the chimeric steroid receptors created by the replacement of the N-terminal part of the steroid receptor molecule by Gal4 DNA binding domain (Gal4 DBD) binding to 9 copies of Gal4 upstream activation sequences (Gal4 UAS) in the promoter of the pGL4 luciferase reporter vector. In the second panel of reporter cell lines the activation of either synthetic promoter containing multiple hormone response elements or viral promoter derived from MMTV LTR is mediated by full- length exogenously expressed steroid receptors. We have extensively validated both panels using 28 well established ligands, carefully analyzed their properties, differences in responses to various ligands as a result of using either chimeric steroid receptor or full- length steroid receptor. We have concluded that a panel of Gal4/LBD reporter cell lines represent powerful, selective, robust and complex tool for profiling of large compound libraries on the whole steroid receptor family mainly due to the high dynamic range of the assay, very low background, resistance to cross talks with intracellular pathways due to the lack of NTD and lower interference with the intracellular processes of the host cells. Although artificial to a certain degree this system also reproduce very well subtle response characteristics of compounds such as partial agonism, mixed agonism/antagonism and complex activity profiles on multiple receptors. While we have identified few artifacts produced by this system compared to full-length steroid receptor reporter system the rank of potencies of many tested compounds was remarkably well conserved. Figure 1. Dose response comparison of U2OS-ERα/3xERE reporter cells (●), U2OS-ERαwt- LBD/9xGal4UAS (○) and U2OS-ERαG420C-LBD/9xGal4UAS cells ( ) exposed to increasing concentrations of selected compounds. Agonistic response of reporter cell lines to E2 (A), DES (B) and PPT (C) is expressed as a ratio of the measured luciferase activity of the compound at the specified concentration and the maximal stimulation of the receptor by E2. In the antagonist mode the cells were incubated with different concentration of ICI 182.780 (D), raloxifene hydrochloride (E) and tamoxifen citrate (F) Panel of full-length steroid receptor reporter cell lines is better suited for the detailed study of mechanisms by which compounds exert their biological effects via specific steroid receptors since this system provides biologically more relevant information about the compound activity by reflecting the activity of other transcription factors, pathways, presence of different cofactors etc. in the cell. We have demonstrated the usefulness of these cell lines by screening a steroid compound library consisting of 3700 compounds and identified new agonistic and antagonistic ligands for selected steroid receptors: PR, MR and GR. A B Figure 2. The effect of E2 on the growth of the mammary ductal tree shown on whole mounts of mammary fat pads from young female mice. Prepubertal intact mice were subcutaneously injected with oily vehicle (A) or 1 μg/day of E2 in oily vehicle (B) for 10 days. After that time mice were sacrificed and the whole mammary fat pads were dissected out, fixed, defatted and stained with haematoxylin. The second part of this work is focused on the structure-activity relationships of different 17α-substituted estradiols on estrogen receptors. We have shown that by carefully selecting substituents in the 17α position of E2 it is possible to generate new ligands with remarkable selectivity to either ERα or ERβ. This approach is elegant since previous successful attempts to prepare selective ligands for ERα managed to control selectivity by targeting different positions of the steroid skeleton. However modifications of substituents on one particular position allowed only the switch from agonistic to antagonistic activity and vice versa or fine-tuning of previously attained properties. E2 PN214 400 Normalized uterine wet weight [%] 350 300 250 200 150 100 50 0 Control 0.001 0.01 0.1 1 10 Dose [ug/animal and day] Figure 3. Estrogenicity of E2 and PN214 in vivo. Prepubertal intact mice were subcutaneously injected with oily vehicle (control) or different concentrations of either E2 or PN214 for 10 days. After that time mice were weighted and sacrificed. Mammary fat pads were removed for whole-mount; uteri and spleens were dissected out and weighed wet. The uterine wet weight was normalized to the whole mouse weight and shown as percentage relative to uterine weight of control mice. Data shown are mean ± SD from 7 mice from each group. We have prepared a series of 17α-perfluoalkylestradiols as highly selective ligands for ERα and a series of 17α-arylestradiols containing selective ligands for ERβ. We have studied their properties using different in vitro methods such as affinity binding assays with recombinant ERs, luciferase cell-based reporter assays, estrogenic proliferation assay with hormone dependent MCF-7 breast cancer cell line and we also carried out in vivo bioassay for estrogenicity in young female mice to assess the estrogenic effect of ERβ selective compound on the growth of mammary glands and uteri. Both of these classes of ligands separate the activity of one ER from another one and considering that natural estrogens are unselective, represent valuable tools for research and potentially important therapeutic agents.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. David Sedlák, Ph.D. 29.99 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. David Sedlák, Ph.D. 145 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. David Sedlák, Ph.D. 186 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Pavel Anzenbacher, DrSc. 238 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Alexander Kasal, DrSc. 115 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 660 kB