velikost textu

Molecular mechanisms of regulation of FcɛRI signaling in mast cells

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Molecular mechanisms of regulation of FcɛRI signaling in mast cells
Název v češtině:
Molekulární mechanismy regulace FcɛRI signalizace žírných buněk
Typ:
Disertační práce
Autor:
Monika Bambousková, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Petr Dráber, DrSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D.
RNDr. Martin Bilej, DrSc.
Id práce:
90913
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
21. 6. 2016
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
SOUHRN Žírné buňky tvoří důležitou součást imunitního systému. Při patologických situacích jsou aktivovány a jsou zodpovědné za alergické reakce. Detailní poznání molekulárních mechanismů vedoucích k jejich aktivaci je proto důležité zejména pro vývoj nových postupů v léčbě alergických reakcí. Nejdůležitějším transmembránovým receptorem žírných buněk je vysokoafinitní Fc receptor pro IgE (FcεRI). FcεRI váže IgE na plasmatické membráně. Po prokřížení polyvalentním antigenem, imunoreceptorové tyrosinové aktivační motivy (ITAM) v intracelularní části receptrou jsou fosforylovány a spouští se signální dráha vedoucí k buněčné aktivaci. Signalizace přes FcεRI po vazbě antigenu je kriticky závislá na interakci s intracelularními protein-tyrosinovými kinasami, které zprostředkovávají fosforylaci ITAM motivů, a zároveň na mnoha dalších komponentách signalizační dráhy. Tato práce byla soustředěna na studium signalizačních procesů vedoucích k aktivaci žírných buněk na několika různých úrovních s důrazem na rané fáze signalizace přes FcεRI. Nejprve jsme se zaměřili na roli protein-tyrosinových fosfatas (PTP) při inicializaci fosforylace FcεRI. Podařilo se nám ukázat, že aktivace FcεRI antigenem vede k oxidaci tyrosinu v aktivním místě PTP a tudíž k jejich inhibici. Topografie inaktivních PTP na plasmatické membráně ukázala jejich bezprostřední blízkost k FcεRI a aktinovému cytoskeletu. Získaná data nám umožnila formulovat nový model inicializace signalizace přes FcεRI. Rovněž jsme se věnovali studiu dalších vybraných proteinů (tetraspaninu CD9, transmembránového adaptorového proteinu PAG a regulátoru serinových palmitoyl transferas ORMDL3) nebo působení vybraných chemikálií jako etanol a metyl-β-cyklodextrin na funkci FcεRI signalosomu během aktivace žírných buněk. Hlavní náplní této práce bylo nalézt nové regulátory FcεRI signalizace. Za tímto účelem byl proveden “screen” s využitím RNA interference, kde jsme identifikovali 15 regulátorů aktivace žírných buněk. Pro detailní funkční analýzu byl vybrán galectin-3 (Gal3). Žírné buňky se sníženou expresí Gal3 vykazovaly zvýšenou degranulaci, vápníkovou odpověď a fosforylaci některých signálních protein po aktivaci antigenem. Přestože Gal3 neovlivňoval fosforylaci FcεRI jako takového, buňky se sníženou expresí vykazovaly defektní internalizaci IgE, doprovázenou sníženou ubikvitinylací receptoru. Gal3 byl tedy identifikován jako stěžejní regulátor řídící stabilitu aktivovaného FcεRI komplexu na plasmatické membráně a následného intracelulárního transportu. Fyziologická funkce žírných buněk záleží také na jejich migraci. Dílčím cílem této práce bylo přispet k poznání signálních drah řídících pohyb žírných buněk. Ukázali jsme, že Gal3 pozitivně reguluje adhezi a motilitu na fibronektinu, zároveň však negativně ovlivňuje chemotaxi za antigenem. Získaná data rovněž napomohla objasnit funkci dalších proteinů (CD9, PAG a ORMDL3) v migraci žírných buněk.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Mast cells are critical component of the immune system. In pathological situations, they are activated and are responsible for allergic reaction. Therefore, detail understanding of mast cell activation at molecular level is important for design of new therapies of allergic diseases. Principal transmembrane receptor of mast cells is the high-affinity Fc receptor for IgE (FcεRI). FcεRI anchors IgE on mast cell surface and upon cross-linking with multivalent antigen it becomes phosphorylated at its intracellular immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs). This triggers signaling cascade leading to cell degranulation and cytokine production. The antigen- mediated signaling through the FcεRI is critically dependent on interplay with intracellular protein- tyrosine kinases that phosphorylate the ITAM motifs and many other components of the signaling pathway. This study was focused on better understanding of signaling events leading to mast cell activation; emphasis was put on early activation events. First, we examined the role of protein- tyrosine phosphatases (PTP) in FcεRI phosphorylation. We found that upon antigen triggering of FcεRI, PTPs undergo inhibition by oxidation of their active site located tyrosine. Studies of plasma membrane topography of inactivated PTPs showed their proximity to FcεRI receptors and actin cytoskeleton. These and other data allowed us to postulate a new model of FcεRI signal initiation. We also investigated the role of selected proteins (tetraspanin CD9, transmembrane adaptor protein PAG, serine palmitoyl transferase regulator ORMDL3) or selected chemicals as ethanol and methyl-β-cyclodextrin on FcεRI signalosome properties in the course of mast cell activation. Major aim of this work was to identify new regulators of FcεRI signaling. For this purpose we performed high-throughput screen using RNA interference technology and identified 15 regulators of mast cell activation. We chose galectin-3 (Gal3) for detail functional analysis of its action in FcεRI signaling pathway. Mast cells with reduced Gal3 expression showed increased antigen-mediated degranulation, calcium response and phosphorylation of several signal- transduction proteins. Although phosphorylation of the FcεRI was not affected, cells with Gal3 knockdown showed impaired IgE internalization that was accompanied by decreased receptor ubiquitination. Thus, we identified Gal3 as a critical regulator controlling FcεRI plasma membrane stability and trafficking. An important role of mast cells in health and disease also depends on their migration. To this end we examined signaling pathways controlling cell movement. We found that Gal3 positively regulates fibronectin-mediated mast cell adhesion and motility but negatively affects antigen-mediated cell chemotaxis. Our data also showed that antigen-mediated mast cell chemotaxis was regulated by CD9, PAG and ORMDL3 proteins.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Monika Bambousková, Ph.D. 1.56 MB
Stáhnout Příloha k práci Monika Bambousková, Ph.D. 50.82 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Monika Bambousková, Ph.D. 112 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Monika Bambousková, Ph.D. 109 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Monika Bambousková, Ph.D. 977 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D. 305 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Martin Bilej, DrSc. 316 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 859 kB