velikost textu

Regulatory functions of the transmembrane adaptor protein NTAL in activation of mast cells

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Regulatory functions of the transmembrane adaptor protein NTAL in activation of mast cells
Název v češtině:
Regulační funkce transmembránového adaptorového proteinu NTAL při aktivaci žírných buněk
Typ:
Disertační práce
Autor:
Ing. Magda Tůmová, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Petr Dráber, DrSc.
Oponenti:
MUDr. Ladislav Vyklický, DrSc.
Ing. Jiří Hašek, CSc.
Id práce:
90909
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
22. 2. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
SOUHRN Žírné buňky pocházejí z kmenových buněk kostní dřeně. Tyto buňky necirkulují v krvi, ale nachází se v celé řadě tkání, kde jsou často umístěny v blízkosti cév. Žírné buňky jsou součástí přirozeného imunitního systému, ale zároveň ovlivňují i adaptivní imunitní systém a také se účastní alergických a zánětlivých reakcí. Žírné buňky mají na svém povrchu vysokoafinitní receptor pro IgE (FcεRI). Prokřížení tohoto receptoru spouští kaskádu reakcí, která vede k uvolnění předpřipravených a nově syntetizovaných efektorových molekul. Časné fáze aktivace těchto buněk zahrnují tyrosinovou fosforylaci četných substrátů a formování signálních komplexů (v angl. “signalosomes”). Důležité strukturní prvky těchto komplexů jsou transmembránové adaptorové proteiny. Jedním takovým proteinem je adaptorový protein NTAL (Non-T cell Activation Linker), který je velmi rychle fosforylován na tyrosinových zbytcích po prokřížení FcεRI a který slouží jako pozitivní, ale i negativní regulátor signálních drah FcεRI. Abychom byli schopni studovat podrobnou topografii proteinu NTAL a dalších molekul plazmatické membrány u žírných buněk odvozených z kostní dřeně (BMMC), nejprve jsme vyvinuli novou metodu izolace listů plazmatické membrány neadherentních buněk. Tato metoda je založena na adsorpci buněk k ultračistému mikroskopickému krycímu sklu, izolaci membránových listů, jejich značení specifickými protilátkami z vnitřní či vnější strany plazmatické membrány, následném značení sekundárními protilátkami konjugovanými s částicemi zlata a zkoumání elektronovým mikroskopem. Při porovnání velikosti shluků FcεRI po aktivaci buněk antigenem jsme u BMMC nenalezli velké shluky typické pro buňky krysí bazofilní leukemie (RBL). Avšak adaptorové proteiny LAT a NTAL, které jsou aktivovány po prokřížení FcεRI, byly lokalizovány v rozdílných oblastech u obou typů buněk. Tyto výsledky naznačují, že zobecňování výsledků dosažených zkoumáním určitého typu žírných buněk by mělo být kriticky zváženo. Pomocí RBL buněk se zvýšenou nebo redukovanou expresí proteinu NTAL jsme ukázali, že tento protein je důležitý pro tyrosinovou fosforylaci řady substrátů a pro formování signálních komplexů v časných fázích aktivace žírných buněk způsobené prokřížením FcεRI. V pozdějších fázích aktivace reguloval NTAL aktivitu vápníkových kanálů zvaných SOC (store-operated calcium channels), ačkoliv jeho fosforylace nebyla zvýšena. Buňky s pozměněnou expresí proteinu NTAL vykazovaly morfologické změny a odlišné hladiny polymerního aktinu po aktivaci FcεRI v porovnání s původními RBL buňkami. To nás dále vedlo ke zkoumání úlohy adaptorového proteinu NTAL v signálních drahách vedoucích k přestavbě aktinového cytoskeletu. BMMC myší postrádajících protein NTAL vykazovaly snížené rozprostírání se na fibronektinu a zvýšenou depolymeraci aktinových vláken po aktivaci žírných buněk antigenem nebo společným působkem antigenu a SCF. Migrace vyvolaná antigenem u těchto buněk byla zvýšena. Dále jsme analyzovali aktivitu Rac a Rho GTPáz. Tato práce je prvním dokladem, že adaptorový protein NTAL hraje klíčovou roli v signální dráze vedoucí k aktinovému cytoskeletu při aktivaci myších žírných buněk vyvolané prokřížením FcεRI a to skrze GTPázu RhoA a kinázu ROCK.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Mast cells originate from hematopoietic pluripotent stem cells present in bone marrow. They do not circulate, but are spread throughout a body and reside in all vascularized tissues. Mast cells as a part of innate immune system are also able to influence adaptive immune system and are effectors in IgE-mediated allergic and inflammatory diseases. Mast cells possess high affinity receptor for IgE (FcεRI). Aggregation of the receptor triggers signaling cascades which lead to the release of preformed and de-novo synthesized effector molecules. Early phases of mast cell activation include tyrosine phosphorylation of numerous substrates and formation of signaling assemblies (also called signalosomes). Important structural components of the signalosomes are transmembrane adaptor proteins. One of them is the transmembrane adaptor protein NTAL (Non-T cell Activation Linker), which becomes rapidly tyrosine- phosphorylated upon FcεRI triggering and serves as a positive or a negative regulator of FcεRI signaling. To be able to study fine topography of NTAL and other plasma membrane components in mouse bone marrow-derived mast cells (BMMCs), we first developed a new method of plasma membrane sheets isolation from non-adherent cells. The method is based on adsorption of the cells to ultraclean glass cover-slips, isolation of the membrane sheets, their labeling from cytoplasmic and/or exoplasmic side with target-specific antibodies followed by gold-conjugated secondary antibodies, and examination under electron microscope. When we compared formation of FcεRI clusters after antigen- mediated activation, we found that large receptor clusters typical for rat basophilic leukemia (RBL) cells were not formed on BMMCs. Surprisingly, downstream adaptor proteins, LAT and NTAL, were localized in isolated domains in both cell types. These results suggest that care should be taken to generalize data from a particular source of mast cells. Using RBL cells with enhanced or reduced NTAL expression we showed importance of NTAL for tyrosine-phosphorylation of several substrates and formation of signalosomes in early stages of FcεRI-mediated signaling. At later stages, we found that NTAL regulates the activity of store-operated calcium channels independently of enhanced NTAL tyrosine phosphorylation. Cells with modified levels of NTAL exhibited changes in morphology and amount of filamentous actin levels after FcεRI triggering. These observations led us to further investigate the role of NTAL in signaling towards actin cytoskeleton. We found, that NTAL-deficient mouse BMMCs exhibited reduced spreading on fibronectin, enhanced filamentous actin depolymerization in response to antigen alone or in combination with SCF, and enhanced migration towards antigen. We also analyzed activity of small GTPases Rac and Rho. We reported for the first time that adaptor protein NTAL signals to actin cytoskeleton via RhoA and ROCK in mouse mast cells in response to FcεRI activation.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Ing. Magda Tůmová, Ph.D. 16.33 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Ing. Magda Tůmová, Ph.D. 99 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Ing. Magda Tůmová, Ph.D. 109 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Ing. Magda Tůmová, Ph.D. 1.03 MB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Ladislav Vyklický, DrSc. 126 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Jiří Hašek, CSc. 89 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 990 kB