velikost textu

Regulační úlohy proteinů PAG a CSK v FcɛRI signalizaci žírných buněk

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Regulační úlohy proteinů PAG a CSK v FcɛRI signalizaci žírných buněk
Název v češtině:
Regulační úlohy proteinů PAG a CSK v FcεRI signalizaci žírných buněk
Název v angličtině:
Regulatory roles of PAG and CSK in FcɛRI signaling of mast cells
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Lucie Potůčková
Školitel:
doc. RNDr. Petr Dráber, DrSc.
Oponenti:
doc. Ing. Peter Šebo, CSc.
prof. RNDr. Vladimír Holáň, DrSc.
Id práce:
90903
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
30. 5. 2017
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
CSK, PAG, FcεRI, C-terminální Src kináza, žírná buňka, BMMC, IgE, cytokiny, STAT5, SHP-1, SFKs, nano-iPCR, ELISA
Klíčová slova v angličtině:
CSK, PAG, FcεRI, C-terminal Src kinase, mast cell, BMMC, IgE, cytokines, STAT5, SHP-1, SFKs, nano-iPCR, ELISA
Abstrakt:
2 ABSTRAKT (CZ) Tato disertační práce je zaměřena především na pochopení regulační úlohy C- terminální Src kinázy (CSK) a proteinu asociovaného s mikrodoménami bohatými na glykosfingolipidy (PAG) v FcɛRI zprostředkované signalizaci myších žírných buněk. FcɛRI aktivace je zahájena agregací receptoru komplexem multivalentního antigenu s IgE a následnou aktivací protein tyrozin kináz, protein tyrozin fosfatáz a dalších molekul signální transdukce. Signalizační děje vedou k degranulaci žírných buněk a uvolnění prozánětlivých mediátorů zodpovědných za vznik alergických onemocnění. Poznání funkce klíčových regulačních molekul, které kontrolují FcɛRI zprostředkovanou aktivaci, degranulaci a cytokinovou produkci žírných buněk, může mít terapeutický dopad. CSK je hlavním negativním regulátorem protein tyrozin kináz z rodiny Src (SFK), které hrají kritickou úlohu v různých imunoreceptorových dějích. Funkce CSK v žírných buňkách však není zcela objasněna. Předpokládá se, že CSK lokalizovaná v cytoplazmě je translokována do blízkosti membránově vázaných SFK s využitím membránových adaptorových proteinů a PAG byl hlavním kandidátem. Pro určení úlohy proteinů CSK a PAG v FcɛRI signalizaci jsme jako model použili žírné buňky odvozené z kostní dřeně (BMMC) myší divokého typu nebo myší deficientních v proteinu PAG (PAG-KO) nebo myší se sníženou expresí CSK (CSK-KD) nebo se sníženou expresí obou těchto proteinů (CSK-KD/PAG-KO). Konkrétně jsme ukázali, že antigenem aktivované buňky s CSK-KD vykazují významně vyšší degranulaci, vápníkovou odpověď a chemotaxi. Překvapivě, PAG měl v těchto dějích opačnou úlohu a buňky s CSK-KD, stejně jako PAG-KO, vykazovaly narušenou fosforylaci transkripčního faktoru STAT5. To bylo pravděpodobně způsobeno zvýšenou enzymatickou aktivitou fosfatázy SHP-1, čímž docházelo k inhibici produkce prozánětlivých cytokinů a chemokinů. Naše výsledky také ukázaly odlišné zapojení adaptorových proteinů LAT a NTAL v CSK- nebo PAG-závislé signalizaci BMMC. Získané výsledky podporují hypotézu, že se CSK váže nejenom na PAG, ale také na jiné adaptorové proteiny, které mohou fungovat lépe než PAG pro lokalizaci CSK v blízkosti SFK, a tím efektivněji přispět k jejich inaktivaci. Na základě těchto výsledků jsme navrhli nový model souhry proteinů CSK a PAG v signalizaci žírných buněk. Protože tyto studie vyžadovaly citlivou detekci různých cytokinů uvolněných z žírných buněk nebo jimi spotřebovávaných, byla část práce věnována vývoji takové metody. Ve spolupráci s dalšími laboratořemi, jsme tuto metodu, nazvanou nano-iPCR, použili pro detekci klinicky významných reportérů v mozkomíšním moku pacientů a srovnali ji s běžnými imunotesty využívající enzymově značené komplexy antigen- protilátka ukotvené na pevných nosičích (ELISAs). Tuto metodu jsme také použili pro určení úlohy ORMDL3 proteinu v signalizaci žírných buněk. Klíčovým zjištěním bylo, že ORMDL3 je negativní regulátor produkce prozánětlivých cytokinů, přes AKT- NF-κB řízenou signální dráhu. Naše výsledky také ukázaly, že chemotaxe žírných buněk je regulována proteiny ORMDL3 a CD9. Dále jsme zkoumali vliv běžně používaného rozpouštědla etanolu a látky odstraňující membránový cholesterol, methyl-β-cyclodextrinu, na FcɛRI signalizaci. Naše výsledky ukázaly, že etanol inhibuje funkci FcɛRI signalozomu, a že cholesterol zde hraje nezastupitelnou úlohu. Tyto výsledky jsme potvrdili na myších in vivo s využitím testu pasivní kožní anafylaxe. 9
Abstract v angličtině:
1 ABSTRACT (EN) This thesis is focused mainly on understanding mechanisms of regulatory roles of C-terminal Src kinase (CSK) and phosphoprotein associated with glycosphingolipid- enriched microdomains (PAG) in the high-affinity IgE receptor (FcɛRI)-mediated signaling of murine mast cells. FcɛRI activation is initiated by aggregation of the receptor by complexes of multivalent antigen with IgE, followed by activation and enhanced activities of protein tyrosine kinases, phosphatases, adaptor proteins and number of other signal transduction molecules. The signaling events result in mast cell degranulation and release of variety of proinflammatory mediators, responsible for initiation of allergy and other inflammatory diseases. Understanding the function of key regulatory molecules controlling FcεRI-mediated mast cell activation, degranulation, and cytokines production could have therapeutic impact. CSK is a major negative regulator of Src family tyrosine kinases (SFKs) that play a critical role in various immunoreceptor signaling events. However, its function in mast cell activation has not been completely understood. Because of its cytoplasmic localization, CSK was assumed to be brought to the vicinity of the plasma membrane- bound SFKs via binding to membrane-bound adaptors and PAG was a major candidate. To determine the roles of CSK and PAG in FcɛRI signaling, we used as a model bone marrow-derived mast cells (BMMCs) from wild-type or PAG knockout (PAG-KO) mice with reduced amount of CSK (CSK-KD) or with reduced amount of both proteins (CSK-KD/PAG-KO). We found that antigen-activated cells with CSK-KD exhibited significantly higher degranulation, calcium response and chemotaxis. Unexpectedly, PAG played an opposite role in these processes and cells with CSK-KD, similarly as PAG-KO, displayed impaired phosphorylation of the transcription factor STAT5. This was probably caused by enhanced enzymatic activity of Src homology region 2 domain- containing phosphatase-1 (SHP-1), which resulted in inhibition of proinflammatory cytokines and chemokines production. Our data also showed distinct involvement of adaptor proteins LAT and NTAL in CSK- or PAG-dependent signaling in BMMCs. Several lines of evidence suggested, that CSK binds not only to PAG, but also to some other anchors, which could serve better than PAG for positioning of CSK in the vicinity of SFKs and thus more efficiently contribute to their inactivation. Based on these data we postulated a new model of CSK-PAG interplay in mast cell activation. Since these studies required sensitive detection of various cytokines released or utilized by mast cells, part of the thesis was dedicated to development of such assay. In collaborative studies we used this method, called nano-iPCR, for detection of clinically relevant markers in cerebrospinal fluid of patients and compared it with routinely used enzyme-link immunosorbent assays (ELISAs). We also used this method for elucidating the role of ORMDL3 protein in mast cell signaling. The key finding was determination of ORMDL3 as a negative regulator of proinflammatory cytokines production, mediated via AKT and NF-κB-directed signaling pathways. Our results also showed that mast cell chemotaxis is regulated by ORMDL3 and CD9. Furthermore, we examined mode of action of widely used dissolving agent, ethanol, and cellular cholesterol remover, methyl-β-cyclodextrin, on FcɛRI activation. Our data indicated that ethanol has an inhibitory effect on function of FcɛRI signalosomes in which cholesterol plays an indispensable role. These data were corroborated in mice in vivo using passive cutaneous anaphylaxis. 8
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Lucie Potůčková 18.09 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Lucie Potůčková 85 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Lucie Potůčková 83 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Lucie Potůčková 369 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Ing. Peter Šebo, CSc. 285 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Vladimír Holáň, DrSc. 160 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 976 kB