velikost textu

Membrane interactions studied by advanced fluorescent techniques: From ions to macromolecules

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Membrane interactions studied by advanced fluorescent techniques: From ions to macromolecules
Název v češtině:
Studium membránových interakcí pomocí pokročilých fluorescenčních technik: Od iontů k makromolekulám
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Šárka Pokorná, Ph.D.
Školitel:
prof. RNDr. Jiří Hudeček, CSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Ivo Konopásek, CSc.
Mgr. Aleš Benda, Ph.D.
Konzultant:
doc. Martin Hof, DSc.
Id práce:
90897
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
8. 9. 2016
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
biologické membrány, membranove interakce, fluorescence, ionty, fuze membran, apoptoza, oxidovane fosfolipidy
Klíčová slova v angličtině:
biological membranes, membrane interactions, fluorescence, ions, membrane fusion, apoptosis, oxidized phospholipids
Abstrakt:
Abstrakt Pokročilé fluorescenční techniky byly využity ke studiu tří různých projektů týkajících se biologických membrán a jejich interakcí. Následující práce je tedy rozdělena do tří samostatných kapitol, z nichž každá pojednává o jednom tématu. 1) Vliv iontů na modelové lipidové membrány byl osvětlen experimentálně metodou časově rozlišených posuvů fluorescence (TDFS, time dependent fluorescence shifts) a teoreticky pomocí molekulárně-dynamických simulací. Kombinace těchto dvou přístupů je vhodná k určení zásadních vlastností membrán jako je pohyblivost a hydratace konkrétní části membrány, uspořádání lipidové dvojvrstvy nebo vazebná místa iontů. Anionty ClO4-, Br-, Cl- a F-, reprezentující Hofmeisterovu řadu, mají tendenci specificky interagovat s kladně nabitými molekulami lipidů v dvojvrstvě, což má vliv na uspořádání membrány. Změny pozorovaných parametrů odpovídají řazení Hofmeistrovy serie iontů. Účinky iontů jsou jak důsledkem přímé interackce iont-lipid, tak zprostředkovány nepřímo, tzn. pozměněním struktury vody v bezprostřední blízkosti molekuly iontu. Další práce, týkající se vápenatých iontů, prokázala, že Ca2+ mají afinitu jak k elektrostaticky neutrálním tak k záporně nabitým fosfolipidovým membránám, vazba iontů ovlivňuje organizaci membrány. Bylo identifikováno několik vazebných míst pro vápník, která se mění v závislosti na jeho koncentraci. 2) Dva komplementární lipopeptidy, CP12K4 a CP12E4, inkorporované do dvou různých lipidových membrán slouží jako minimalistický modelový aparát vyvolávající fúzi těchto membrán. Použitím technik FCS a FRET bylo zjištěno, že oba lipopeptidy se v membráně chovají rozdílně. Přítomnost CP12K4 v membráně zpomaluje pohyb lipidových molekul, laterálně komprimuje membránu a ve vyšších koncentracích klastruje. Navíc, peptidová část molekuly, K4, má tendenci zanořovat se lipidové dvojvrstvy. Nic z toho nebylo pozorováno pro druhý lipopeptid CP12E4. Dále byl nastíněn možný průběh první fáze fúze, tedy vazba peptidu K4 na vezikuly obsahující CP12E4. Porozumění chování molekul lipopeptidu v membráně a pochopení mechanismu fúze může pomoci při konstrukci účinného a specifického modelu použitelného pro in vivo aplikace, jako je například cílený transport léčiv. 3) Vnitřní apoptotická dráha je těsně spjata s vnější mitochondríální membránou. O životě a smrti zde rozhoduje rodina proteinů Bcl-2. Protein Bax (člen Bcl-2 rodiny) se po aktivaci zanořuje do vnější mitochondriální membrány, oligomerizuje a tvoří póry. Vliv oxidačního stresu, který byl simulován přídavkem oxidovaného fosfolipidu do modelových mitochondriálních membrán, na účinek proteinu Bax byl sledován pomocí metod průsaku fluorescenčního barviva. Přítomnost oxidovaného fosfolipidu PazePC v lipidové membráně zvyšuje rychlost úniku barviva skrz membránu zatímco frakce proteklých vezikul se nemění. Vlivem oxidačního stresu jsou póry v membránách obsahujících PazePC větší než v těch bez oxidovaného lipidu, jejich velikost však stále není dostatečná k propagaci apoptotického signálu.
Abstract v angličtině:
Abstract Advanced fluorescence techniques were used to explore tree distinct topics concerning biological membrane and their interactions. Following thesis is according to the topic divided into three parts: 1) Ionic effects were studied employing time dependent fluorescence shift experiments and molecular dynamic simulations. Combination of these two approaches are suitable to reveal characteristic like mobility and hydration of particular bilayer segment, lipid packing or ion binding sites. Halide anions were reported to adsorb to the cationic lipid bilayer specifically, altering membrane mobility and organization. Changes in observed parameters follows Hofmeister order. Their effect is mediated either by direct ionic interaction (soft, polarizable ions) as well as via alteration of water structure (hard, non-polarizable ions) in proximity of ion molecule. Further, divalent calcium was shown to bind strongly to neutral and negatively charged lipid bilayers. Several types of binding sites depending on calcium concentration were identified. 2) Two complementary lipopeptides, CPK and CPE, incorporated into distinct lipid bilayers serve as a minimal model inducing membrane fusion. Effectiveness of fusion event might be influenced by lipopeptide-membrane and lipopeptide-lipopeptide interaction. To reveal molecular mechanism of such interactions confocal microscopic techniques, FCS and FRET, were employed. The two molecules were found to behave in strikingly different manner. While CPE incorporates homogenously, CPK compress the bilayer, forms clusters and the peptide K has the tendency to snorkel into membrane headgroup region. Understanding the molecular mechanism is important for designing effective model for in vivo applications, like drug delivery. 3) Intrinsic apoptotic pathway is tightly connected with mitochondrial membrane. Life or death decision there is controlled by Bcl-2 protein family. Oxidized phospholipids (OxPls) generated in the mitochondrial membrane during oxidative stress directly affect the onset and progression of mitochondria-mediated apoptosis. Bax (pro-apoptotic member of Bcl-2 family) pore forming activity in mitochondria like model vesicles doped with oxidized phospholipid PazePC was followed using leakage assays. It was shown that Bax-induced leakage, especially its rate, increased with the vesicles’ PazePC content. Although the size of Bax pores is not sufficient for apoptosis progression.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Šárka Pokorná, Ph.D. 4.55 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Šárka Pokorná, Ph.D. 4.79 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Šárka Pokorná, Ph.D. 115 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Šárka Pokorná, Ph.D. 108 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Šárka Pokorná, Ph.D. 693 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Ivo Konopásek, CSc. 280 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Aleš Benda, Ph.D. 223 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 717 kB