velikost textu

Development of analytical tools for quantification and screening for inhibitors of glutamate carboxypeptidases II and III

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Development of analytical tools for quantification and screening for inhibitors of glutamate carboxypeptidases II and III
Název v češtině:
Vývoj analytických nástrojů pro kvantifikaci a hledání inhibitorů glutamátkarboxypeptidas II a III
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Václav Navrátil
Školitel:
doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D.
prof. MUDr. Aleksi Šedo, DrSc.
Id práce:
90335
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
10. 9. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Zveřejnění práce bylo odloženo do 09.09.2020
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
GCPII, PSMA, NAALADasa, FOLH1, GCPIII, CAIX, qPCR, qRT-PCR, DIANA.
Klíčová slova v angličtině:
GCPII, PSMA, NAALADase, FOLH1, GCPIII, CAIX, qPCR, qRT-PCR, DIANA.
Abstrakt:
Abstrakt Glutamát karboxypeptidasa II (GCPII), známá také jako prostatický specifický membránový antigen (PSMA), je membránová metalopeptidasa exprimovaná zejména na buňkách karcinomu prostaty (PCa). Látky cílící GCPII pro zobrazování a léčbu PCa jsou ve vývoji a ukazují nadějné výsledky v pokročilých fázích klinického testování. Některé studie ukázaly, že GCPII by mohla být využita také jako krevní marker PCa, což ale zatím nebylo potvrzeno kvůli absenci metod vhodných pro přesnou detekci GCPII v krvi. GCPII je exprimována také v mozku, kde štěpí inhibiční N-Acetyl-α-L-aspartyl-L- glutamát (NAAG) na excitační L-glutamát a inhibice GCPII je neuroprotektivní ve zvířecích modelech několika neuropatií. Silné inhibitory GCPII byly nalezeny pomocí racionálního vývoje, ale všechny vykazují nedostatečnou biodostupnost aby mohly být využity v klinické praxi. Nalezení nových strukturních motivů je tedy nezbytné, nicméně zatím nebyla vyvinuta žádná metoda vhodná pro účinné testování inhibitorů GCPII. V mozku se nalézá také málo prozkoumaná glutamát karboxypeptidasa III (GCPIII), která také štěpí NAAG. Její studium je tak nutné pro pochopení funkce GCPII a pro cílení GCPII v medicíně. V této práci jsme se zaměřili na vývoj nových metod pro kvantifikaci obou enzymů a pro hledání jejich inhibitorů. Nejprve jsme vyvinuli qRT-PCR a radioenzymové stanovení pro kvantifikaci GCPII a III v lidských a myších tkáních a ověřili, že GCPII se v myši na rozdíl od člověka nenachází v prostatě a tenkém střevu. Dále jsme vyvinuli několik vzájemně se doplňujících stanovení pro detekci GCPII v krvi a určili jsme jimi hladiny GCPII v krvi zdravých lidí a pacientů trpících PCa. Bohužel jsme ukázali, že GCPII patrně nelze využít jako sérový marker PCa. Nakonec jsme vyvinuli zcela novou metodu detekce enzymů DIANA založenou na vazbě enzymu na protilátku a jeho detekci skrze inhibitor navázaný na DNA oligonukleotid. Na příkladu GCPII a CAIX, což je další nádorový marker a potenciální terapeutický cíl, jsme ukázali, že tato metoda je vhodná nejen pro ultracitlivou detekci enzymů, ale také pro účinné hledání jejich inhibitorů bez potřeby purifikovaného enzymu. To dělá DIANA metodu výjimečným nástrojem pro detekci biomarkerů a vývoj léčiv.
Abstract v angličtině:
Abstract Glutamate carboxypeptidase II (GCPII) usually called prostate specific membrane antigen (PSMA) is membrane bound metallopeptidase expressed mainly in prostate carcinoma (PCa). Agents targeting GCPII suitable for both imaging and treatment of PCa are in development and they show promising results in advanced clinical trials. Some studies showed that GCPII may serve also as PCa blood serum marker, but this has not been validated due to the lack of methods suitable for accurate detection of GCPII in human blood. Moreover, GCPII is also expressed in brain, where it cleaves inhibitory N-acetyl-α-L- aspartyl-L-glutamate (NAAG) to release excitatory L-glutamate and GCPII inhibition has been shown to be neuroprotective in animal models of several neuropathies. Tight binding inhibitors of GCPII have been identified by rational design, but all have poor bioavailability and thus cannot be used in clinics. Identifying new scaffolds by 'brute force' screening methods is thus essential; however, no such method for GCPII has been developed so far. Glutamate carboxypeptidase III (GCPIII) is also expressed in brain and cleaves NAAG. It is thus an important protein for understanding of GCPII function as well as GCPII targeting in medicine. Here, we focused on development of novel methods for quantification of both enzymes and screening of their inhibitors. First, we developed qRT-PCR and radioenzymatic assays to quantify GCPII and GCPIII in human and mice tissues and proved lack of GCPII in murine prostate and intestine. We also developed several orthogonal assays for detection of GCPII in blood and determined GCPII blood levels in healthy and PCa individuals. Unfortunately, we showed that GCPII is not useful as a serum marker of PCa. Finally, we developed a novel method for enzyme detection (DIANA), which is based on dual recognition of the enzyme by immobilized antibody and DNA-linked inhibitor. We showed on the example of GCPII and CAIX, which is also a putative cancer marker and potential drug target, that this method is useful not only for ultrasensitive enzyme detection but also for screening of enzyme inhibitors without the need to purify the target enzyme. This makes DIANA a superior tool for biomarker detection and drug discovery.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Václav Navrátil 25.25 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Václav Navrátil 248 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Václav Navrátil 243 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Václav Navrátil 736 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. 300 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. MUDr. Aleksi Šedo, DrSc. 138 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1024 kB