velikost textu

Human glutamate carboxypeptidases II and III

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Human glutamate carboxypeptidases II and III
Název v češtině:
Lidské glutamátkarboxypeptidasy II a III
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Michal Navrátil, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D.
RNDr. Jiří Pavlíček, Ph.D.
Id práce:
90060
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
20. 6. 2016
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
GCPII, GCPIII, vztah mezi strukturou a aktivitou, testování aktivity, určování struktury pomocí rentgenové difrakce
Klíčová slova v angličtině:
GCPII, GCPIII, structure - activity relationship, activity assay, X-ray structure determination
Abstrakt:
ABSTRAKT Zde presentovaná doktorská disertační práce popisuje kinetickou a strukturní characterisaci lidských glutamátkarboxypeptidas II a III (GCPII a GCPIII) za použití jejich přirozených substrátů. Tyto enzymy odštěpují C-koncový glutamát z jejich substrátů. Proteiny sdílejí 67 % sekvenční identitu a také podobné enzymové aktivity. Tato disertační práce kvantitativně porovnává lidskou GCPII a GCPIII co se týče jejich schopnosti hydrolysovat endogenní substráty N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamát (NAAG), folyl-poly-γ-L- glutamové kyseliny (FolGlun) a β-citryl-L-glutamát (BCG). Prokázali jsme, že hydrolysa těchto substrátů pomocí GCPIII je závislá na přítomnosti kationtů kovů, že BCG je specifický substrát GCPIII, a že NAAG a FolGlun jsou specifické substráty GCPII. Rovněž přinášíme nepřímé biochemické důkazy o tom, že GCPIII by mohla mít v aktivním místě heterometalický klastr. Také jsme charakterisovali relevanci povrchového vazebného místa v GCPII, takzvaného aromatické skupiny vázajícího místa (ASVM), pro hydrolysu FolGlun substrátů za použití metody cílené mutagenese basí DNA a enzymové kinetiky a ukázali jsme, že polymorfní varianta GCPII His475Tyr hydrolysuje substráty FolGlun se stejnými kinetickými parametry jako divoký typ. Dále se tato disertační práce se zaměřuje na strukturní aspekty substrátových specifit GCPII a GCPIII: předkládáme zde krystalové struktury neaktivního mutantu GCPII, Glu424Ala, v komplexu se svými substráty FolGlu1-3 a BCG. FolGlu1-3 komplexy ukazují jak se ASVM zbytky v GCPII - Arg463, Arg511 a Trp 541 - účastní vazby aromatického pteridinového kruhu těchto substrátů. Tyto nálezy jsou doplněny vyspělými kvantově mechanickými a molekulově mechanickými (QM/MM) výpočty, které ukazují, jak se BCG pravděpodobně váže do aktivního místa GCPIII a jak by Ca-Zn heterometalický klastr v aktivním místě GCPIII mohl vypadat. Nakonec jsme změřili kinetiku hydrolysy N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamyl-L-glutamátu (NAAG2) enzymy GCPII a GCPIII. Dále jsme kvantifikovali tkáňové zastoupení GCPII a GCPIII v lidských tkáních, a to jak na úrovni mRNA, tak proteinu, čímž jsme ukázali nejvyšší expresi GCPIII ve varlatech. Spolu s tím je diskutována možná úloha BCG jako chelátoru železa. Tato disertační práce je rovněž doplněna strukturní charakterisací lipofilních inhibitorů GCPII a objevem mírně specifického inhibitoru GCPIII.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT The herein presented Ph.D. dissertation describes kinetic and structural characterization of human glutamate carboxypeptidases II and III (GCPII and GCPIII) using a complete panel of their natural substrates. These enzymes hydrolyze C-terminal glutamate from their substrates. They share 67 % sequence identity and also similar enzymatic activities. This thesis quantitatively compares human GCPII and GCPIII in terms of their ability to hydrolyze the substrates N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamate (NAAG), folyl-poly-γ-L-glutamic acids (FolGlun) and β-citryl-L-glutamate (BCG). We demonstrated that GCPIII hydrolyzes its substrates in a metal- dependent manner, that BCG is a specific substrate of GCPIII, and that NAAG and FolGlun are specific substrates of GCPII. We also provide indirect biochemical evidence that GCPIII might feature a heterometallic active-site cluster. Additionally, we characterized the relevance of a surface exosite of GCPII, the arene-binding site (ABS), for the hydrolysis of FolGlun substrates using mutagenesis and enzyme kinetics and showed that polymorphic His475Tyr variant of GCPII hydrolyzes FolGlun substrates with the same kinetic parameters as the wild-type enzyme. Furthermore, this thesis focuses on structural aspects of the substrate specificities of GCPII and GCPIII: we present the X-ray structures of inactive mutant of GCPII, Glu424Ala, in complex with its substrates FolGlu1-3 and BCG. The FolGlu1-3 complexes show how ABS residues of GCPII - Arg463, Arg511 and Trp 541 - participate in binding the aromatic pteridine ring of these substrates. These findings are complemented by high-level quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) calculations which reveal how BCG probably binds to the active site of GCPIII and how a calcium-zinc heterometallic active-site cluster of GCPIII might look like. Finally, we also quantified the kinetics of the N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamyl-L-glutamate (NAAG2)-hydrolyzing activity of GCPII and GCPIII. Further, we quantified the tissue distribution of GCPII and GCPIII (in human tissues) both at the mRNA and the protein level, showing highest expression of GCPIII in testes and discussing its possible role as an iron chelator. The thesis is rounded off with structural characterizatin of lipophilic inhibitors of GCPII and the discovery of a moderately specific inhibitor of GCPIII.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Michal Navrátil, Ph.D. 8.61 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Michal Navrátil, Ph.D. 20 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Michal Navrátil, Ph.D. 16 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Michal Navrátil, Ph.D. 1.1 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. 230 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jiří Pavlíček, Ph.D. 140 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 854 kB