velikost textu

Mechanism of action of adenylate cyclase toxin on immune function of dendritic cells

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Mechanism of action of adenylate cyclase toxin on immune function of dendritic cells
Název v češtině:
Mechanismus působení adenylátcyklázového toxinu na imunitní funkce dendritických buněk
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Martina Švédová
Školitel:
doc. Ing. Peter Šebo, CSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D.
prof. MUDr. Jiří Stulík, CSc.
Id práce:
90017
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
30. 5. 2017
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Abstrakt Adenylátcyklázový toxin (CyaA) je klíčovým faktorem virulence bakterie Bordetella pertusis, která je původcem černého kašle. CyaA se váže na fagocyty, které exprimují na svém povrchu komplementový receptor 3 a poté katalyzuje rychlou přeměnu ATP na cAMP, které rozvrací buněčnou signalizaci. Zároveň CyaA tvoří uvnitř buněčné membrány kation-selektivní póry, které zapříčiňují únik draslíku z buněčného cytosolu. Enzymaticky neaktivní forma CyaA toxinu, adenylátcyklázový toxoid (CyaA-AC-), se používá jako nástroj pro dopravu antigenů již 20 let. Tato práce se zaměřila především na studium mechanismu působení CyaA toxoidu a toxinu. Zkoumali jsme adjuvantní účinky CyaA toxoidu, jeho kapacitu nořit se do buněčné membrány a možnost jeho využití pro dopravu epitopů z chřipkového viru. Ukázali jsme, že pórotvorná aktivita toxoidu a následná aktivace MAP kináz JNK a p38 jsou klíčové pro adjuvantní účinek toxoidu CyaA-AC- a způsobují maturaci dendritických buněk (DC - z angl. dendritic cells), nezávislou na signalizaci TLR (z angl. Toll-like receptor) drah a inflamazómu. K stimulaci dendritických buněk dochází dokonce i in vivo a toxoidem aktivované DC jsou pak schopné navodit CD8+ a CD4+ T buněčné odpovědi in vitro a in vivo. Dále jsme ukázali, že prvních 371 aminokyselin je postradatelných pro schopnost CyaA dopravovat vložené epitopy do buněčného cytosolu, a že tudíž role AC domény při procesu penetrace toxinu do buňky je spíše pasivní. Konstrukt CyaA toxoidu s vloženým antigenem HA2 podjednotky hemaglutininu chřipkového viru A navodil látkovou i buněčnou imunitní odpověď v myších bez použití dalšího adjuvans a ochránil je proti infekci homologním i heterologním chřipkovým virem. Také jsme zkoumali roli CyaA toxinu při infekci. CyaA manipuluje lidské a myší DC stimulované TLR tak, že dochází ke zvýšenému zániku buněčných adhezivních kontaktů, následnému zvýšení chemotaktické migrace a snížení schopnosti dendritických buněk předkládat bílkovinné antigeny a navodit tak proliferaci antigen-specifických CD4+ a CD8+ T buněk. Ukázali jsme, že CyaA manipulace myších DC in vitro je závislá výhradně na cAMP signalizaci, nikoli na pórotvorné aktivitě CyaA. Na myším modelu jsme dále prokázali, že pórotvorná aktivita CyaA není nutná pro bakteriální kolonizaci, avšak zvyšuje infiltraci neutrofilů a významně přispívá k plicní patologii během pertusové infekce.
Abstract v angličtině:
Abstract The adenylate cyclase toxin (CyaA) is a key virulence factor of the whooping cough agent Bordetella pertussis. CyaA primarily penetrates CR3-expressing myeloid phagocytes and subverts cellular signaling by a rapid conversion of ATP to cAMP. In parallel, CyaA can form cation-selective pores within cellular membrane, provoking massive potassium efflux from cell cytosol. An enzymatically inactive adenylate cyclase toxoid (CyaA-AC-) has then been abundantly used as an efficient antigen delivery tool over the past 20 years. This work focused mainly on the mechanism of action of CyaA toxin and of its toxoid on dendritic cells. We studied the potency of the CyaA toxoid to act as adjuvant, its penetration capacity and its potential use in delivery of influenza epitopes. We show that the pore-forming activity and the activation of MAP kinases JNK and p38 were crucial for the adjuvant effects of the CyaA-AC-, which provokes maturation of dendritic cells (DC) independently of Toll-like receptor (TLR) or inflammasome signaling. Furthermore, such CyaA-AC--stimulated DC acquired the ability to induce CD8+ and CD4+ T cells responses, as was determined both in vitro and in vivo. We further showed that the first 371 amino acids are dispensable for the capacity of CyaA to deliver its AC domain with inserted epitopes into cytosol of DC, implicating that the role of the AC domain polypeptide in the process of translocation across the cytoplasmic membrane of cells is rather passive. Our CyaA toxoid construct with an inserted antigen from the HA2 subunit of the hemagglutinin of influenza A viruses then induced both humoral and cellular immune responses in mice without the need for any added adjuvant and the responses protected mice against challenge with both homologous and heterologous influenza A viruses. We further examined the role of the CyaA toxin in virulence of B. pertussis. We analysed the modulatory effects of CyaA action on TLR-activated murine and human DC. CyaA enhanced TLR- induced dissolution of cell adhesive contacts and chemotactic migration of DC in vitro, while it decreased the capacity of DC to present protein antigens and induce proliferation of antigen- specific CD4+ and CD8+ T cells. Manipulation of mouse DC by CyaA in vitro was shown to depend solely on the cAMP signaling and not on the pore-forming activity of the toxin. We further demonstrated in the mouse respiratory challenge model that the pore-forming activity of CyaA was not required for bacterial colonization. It, however, provoked neutrophil infiltration and the pore- forming activity importantly contributed to the overall pathology of lungs infected by B. pertussis.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Martina Švédová 42.69 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Martina Švédová 320 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Martina Švédová 248 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Martina Švédová 1.9 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D. 410 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. MUDr. Jiří Stulík, CSc. 276 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 996 kB