velikost textu

Impact of the glycine-rich loop on the function of processing peptidases of the mitochondrial type

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Impact of the glycine-rich loop on the function of processing peptidases of the mitochondrial type
Název v češtině:
Vliv glycinové smyčky na funkci "processing" peptidas mitochondriálního typu
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Tomáš Kučera, Ph.D.
Školitel:
Ing. Jiří Janata, CSc.
Oponenti:
RNDr. Cyril Bařinka, Ph.D.
prof. doc. RNDr. Mgr. Rüdiger Ettrich, Ph.D.
Id práce:
89935
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
17. 6. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
mitochondrie, signalni peptidasa, proteinovy transport, signalni sekvence
Klíčová slova v angličtině:
mitochondrion, signal peptidase, protein transport, signal sequence
Abstrakt:
SOUHRN Většina mitochondriálních proteinů je syntetizována na cytosolických ribozomech ve formě svých prekurzorů nesoucích signální sekvence, které umožňují jejich transport do mitochondrií. Jakmile proteinový prekurzor dosáhne mitochondriální matrix, signální sekvence již není potřeba a je odštěpena heterodimerní mitochondriální „processing“ peptidasou (MPP; α/β). Ačkoli krystalová struktura MPP je známa, mechanismus funkce MPP je stále předmětem diskusí. Volná molekulárně-dynamická (MD) simulace byla použita k detailnímu studiu strukturních znaků glycinové smyčky (GRL) regulační α-podjednotky kvasinkové MPP. Struktury divoké a mutantní formy MPP s delecí celé glycinové smyčky byly studovány i v přítomnosti substrátu v aktivním místu peptidasy. Cílená MD simulace byla použita ke studiu mechanismu translokace substrátu z GRL do aktivního místa. Prokázali jsme, že přirozená konformační flexibilita GRL je zcela zásadní pro translokaci substrátu z okolního prostředí do aktivního místa peptidasy. Ukazujeme, že α-helikální konformace substrátu je důležitá nejen během jeho prvotního kontaktu s MPP (t.j. rozpoznání substrátu), ale také později, přinejmenším během prví třetiny translokační dráhy substrátu. Dále ukazujeme, že substrát zůstává v kontaktu s GRL během celé první třetiny translokace, během níž hydrofóbní kontakty hrají zásadní roli. Nakonec shrnujeme, že GRL je jemně vyvážený struktuní prvek, který drží podjednotky MPP v částečně uzavřené konformaci, bez ohledu na přítomnost substrátu v aktivním místě peptidasy. Hydrogenosomy jsou evolučně příbuzné redukované formy mitochondrií, které obsahují peptidasu typu MPP – hydrogenosomální „processing“ peptidasu (HPP; α/β). Ukazujeme, že HPP je funkční jako heterodimer skládájící se z regulační α- and katalytické β-podjednotky, a že zpracovává stejnou sadu substrátů jako MPP. Na rozdíl od MPP, krystalová struktura HPP nebyla dosud vyřešena. Kromě krystalizačních experimentů jsme využili pokročilé metody strukturní biologie ke studiu strukturních rysů HPP. Konkrétně, užitím metody biologického rozptylu rentgenových paprsků a metody výměny vodíkových atomů za deuterium ukazujeme, že HPP nevykazuje konformační změny v závislosti na přítomnosti substrátu v aktivním místě. Ukazujeme, že zatímco divoká forma HPP má velmi pravděpodobně stejnou kvartérní organizaci jako MPP, tak struktura proteolyticky neaktivní formy HPP se liší od divoké. S ohledem na představu, že mitochondrie jsou α-proteobakteriílního původu, a s ohledem na fakt, že peptidasy typu MPP byly nalezeny také v bakteriích, jsme vypracovali evoluční scénář pro MPP. Zatímco MPP a, velmi pravděpodobně také, HPP obsahují „plnou“ GRL, tak bakteriální peptidasy typu MPP obsahují pouze „embryonální“ GRL, pokud vůbec, což souhlasí s jejich biologickými funkcemi. Shrnujeme, že přítomnost „plné“ GRL může být považována za evoluční značku fyziologické funkce dané peptidasy typu MPP. Dále shrnujeme, že předchůdce MPP byl připojen ke vnitřní membráně mitochondrie ve formě podobné heterodimerní peptidase ze Sphingomonas sp., kde proběhlo prodloužení GRL ze své „embryonální“ do „plné“ podoby, a tedy, kde se ustanovila funkce „processing“ peptidasy. V tomto smyslu dále shrnujeme, že MPP je ukázkový příklad evoluce eukaryotické buňky řízené organelou.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT The majority of the mitochondrial proteins is synthetized on the cytosolic ribosomes in the form of the protein precursors bearing mitochondrion-targeting signal presequences. Once the protein precursor has reached the mitochondrial matrix the signal presequence is no longer necessary and is cleaved off by heterodimeric mitochondrial processing peptidase (MPP; α/β). Although the crystal structure of MPP is available, the MPP mechanism of function is still matter of discussion. An all atomic, non-restrained molecular dynamics (MD) simulation in explicit water was used to study in detail the structural features of the highly conserved glycine-rich loop (GRL) of the regulatory α-subunit of the yeast MPP. Wild-type and GRL-deleted MPP structures were studied both in the presence and absence of a substrate in the peptidase active site. Targeted MD simulations were employed to study the mechanism of substrate translocation from the GRL to the peptidase active site. We demonstrate that the natural conformational flexibility of the GRL is crucial for the substrate translocation process from outside the enzyme towards the MPP active site. We show that the α-helical conformation of the substrate is important not only during its initial interaction with MPP (i.e. substrate recognition), but also later, at least during the first third of the substrate translocation trajectory. Further, we show that the substrate remains in contact with the GRL during the whole first half of the translocation trajectory where hydrophobic interactions play a major role. Finally, we conclude that the GRL acts as a precisely balanced structural element, holding the MPP subunits in a partially closed conformation regardless the presence of a substrate in the active site. Hydrogenosomes are evolutionary related reduced versions of mitochondria that possess MPP-like peptidase – hydrogenosomal processing peptidase (HPP; αβ). We show that HPP is functional as a heterodimer consisting of a regulatory α-subunit and catalytic β-subunit and processes the same set of signal presequences as MPP. On contrary to the MPP, the crystal structure of HPP has not yet been solved. Beside of the crystallization attempts we employed advanced methods of structural biology to study the structural features of HPP. Specifically, using biological small-angle X-ray scattering and hydrogen-deuterium exchange methods we show that HPP does not undergo conformation changes depending on whether the peptide substrate is or is not present in the peptidase active site. We show that while the wild-type HPP resembles very likely the same quaternary organization as MPP, the structure of the proteolytically inactive E56Q mutant differs from the wild-type one. Chemical cross- linking confirms the low validity of HPP homologous model and suggests that β-HPP is capable of forming homodimers. With regard to the idea that mitochondria are of the α-proteobacterial origin and to the fact that MPP- like peptidases have been found also in bacteria we worked out an evolutionary scenario for MPP. While MPP and very likely also HPP contain the “full length” GRL, the bacterial MPP-like peptidases contain only the “embryonal” GRL, if any, which is consistent with their biological functions. We conclude that the presence or absence of the “full length” GRL can be considered as evolutionary marker of the physiological function of the given MPP-like peptidase. Furthermore, we hypothesize that the ancestral MPP was attached to mitochondrial inner membrane in the form similar to the Sphingomonas sp. heterodimeric peptidase where the prolongation of GRL from the “embryonal” to the “full length” form occurred and, thus, the MPP physiological function of processing peptidase was established. In this context, we also conclude that MPP is an illustrative example of the organelle-driven evolution of the eukaryotic cell.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Tomáš Kučera, Ph.D. 5.32 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Tomáš Kučera, Ph.D. 22.86 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Tomáš Kučera, Ph.D. 100 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Tomáš Kučera, Ph.D. 101 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Tomáš Kučera, Ph.D. 1.05 MB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Cyril Bařinka, Ph.D. 381 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. doc. RNDr. Mgr. Rüdiger Ettrich, Ph.D. 216 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 981 kB