velikost textu

The study of model membrane systems, proteins and protein-membrane interactions using various fluorescence techniques

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
The study of model membrane systems, proteins and protein-membrane interactions using various fluorescence techniques
Název v češtině:
Studium modelových membrán, proteinů a protein-membránových interakcí pomocí různých fluorescenčních technik
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Martin Štefl, Ph.D.
Školitel:
prof. RNDr. Jiří Hudeček, CSc.
Oponenti:
Ing. Jan Teisinger, CSc.
prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc.
Konzultant:
doc. Martin Hof, DSc.
Id práce:
89791
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
17. 12. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
Modelové membrány, interakce proteinu s membránou, dynamika membrán, fluorescence
Klíčová slova v angličtině:
Model membrane systems, protein-membrane interaction, membrane dynamics, fluorescence
Abstrakt:
Abstrakt Membránové rafty (také často uváděny jako nanodomény) jsou membránové struktury, které jsou zodpovědné za spoustu buněčných procesů. Jejich charakterizace je velice složitá, protože nanodomény jsou opticky průhledné, jejich velikost je pod rozlišením optických mikroskopů a dynamika je veliká. Navíc vysoká různorodost buněk ještě více komplikuje jejich studium. Pro zjednodušení buněk jsou velice často používány membránové modelové systémy jako obrovské unilamelární vezikuly (GUVs) nebo podporované fosfolipidové dvojvrstvy (SPBs). V mé disertační práci byly vyvinuty, testovány a vylepšovány různé fluorescenční techniky ke studiu těchto membránových domén v modelových systémech. Fázorová analýza, metoda pro analýzu dat dob dohasínání fluorescence, byla teoreticky a experimentálně testována a následně použita k charakterizaci membránových nanodomén v GUVs. Nejdříve jsme využili fázorovou analýzu v lipidových vezikulech ke studiu procesů excitovaných stavů, jako je jev relaxace rozpouštědla a Försterův rezonanční přenos energie (FRET). Dále jsme aplikovali fázorovou analýzu k charakterizaci interakcí mezi proteiny a ligandy, ke studiu sbalování a denaturace proteinů. Nakonec jsme použili fázorovou analýzu dat z FRET v kombinaci s fluorescenční korelační spektroskopií (FCS) k charakterizaci membránových nanodomén z hlediska velikosti, mobility a mechanismu tvorby. Jako první jsme uspěli v určování velikosti a dynamiky nanodomén v GUVs, které jsou menší než je rozlišení optického mikroskopu. Z našich poznatků jsme nakonec byli schopní udělat obecné závěry ohledně mechanismu tvorby nanodomén. Laterální difúze slabě vázaných proteinů koagulační kaskády na podporovaných membránách byla druhým membránovým procesem, který jsme studovali. Vyvinuli jsme metodu z-scan FCS v dvoubarevném v alternačním modu excitace, pomocí které jsme byli schopni současně charakterizovat laterální difúzi proteinu a lipidu. Ačkoliv difúze proteinu je dvakrát pomalejší ve srovnání s lipidy v membráně, koncentrační závislosti ukazují jistou spojitost těchto dvou difúzních procesů. 3
Abstract v angličtině:
Abstract Membrane rafts (also referred as nanodomains) are membrane structures responsible for many cell processes. Their characterization is challenging because of the transparency, dynamics and small size of those structures. Moreover, high variability of cells makes their study even more complicated. In order to simplify the studies of membrane processes including the formation of those rafts often model membranes like Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) and Supported Phospholipid Bilayers (SPBs) are used. In this Thesis new fluorescent tools for studying such membrane processed were developed, tested, or improved. Specifically, the phasor plot an approach applicable to the analysis of the fluorescence lifetime data, was theoretically and experimentally tested and afterwards applied to the characterization of the membrane nanodomains in GUVs. First, we introduced the phasor plots to the excitation state processes like solvent relaxation and Förster resonance energy transfer (FRET) in lipid vesicles. We also employed the phasor plots in protein-ligand interaction, protein folding and denaturation studies. Finally, the phasor plot analysis of FRET data in combination with Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) was used in characterization of membrane nanodomains in terms of the size, mobility and mechanisms of formation. We succeeded for the first time to determine the size and dynamics of nanodomains in GUVs smaller than 20 nm in radius. Our findings allowed us to make general conclusion on the mechanism of raft formation. The lateral diffusion on SPBs of a weakly bound blood coagulation protein was the second membrane process being studied. By developing a 2-color z-scan FCS approach using pulsed interleaved excitation, we were able to simultaneously characterize this protein diffusion and lipid diffusion. Although the protein diffusion is about two times slower that the lipid diffusion, the lipid composition and protein concentration dependencies suggest that both processes are to some extend coupled. 2
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Martin Štefl, Ph.D. 11.64 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Martin Štefl, Ph.D. 45 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Martin Štefl, Ph.D. 44 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Martin Štefl, Ph.D. 672 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Jan Teisinger, CSc. 93 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc. 368 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1.03 MB