velikost textu

Molecular mechanisms underlying maintenance of genome stability

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Molecular mechanisms underlying maintenance of genome stability
Název v češtině:
Studium molekulárních mechanismů udržujících stabilitu genomu
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Kamila Burdová, Ph.D.
Školitel:
Dr. Pavel Janščák, Ph.D.
Oponenti:
Ing. Eva Cséfalvay, Ph.D.
doc. Mgr. Lumír Krejčí, Ph.D.
Id práce:
89790
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
25. 11. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
ABSTRAKT Buňky v našem těle jsou každý den vystaveny poškození DNA vlivem endogenních a exogenních faktorů. Schopnost buněk opravit poškozenou DNA je důležitá pro zachování genetické informace. Mezi nejvíce cytotoxické DNA léze patří dvojvláknové zlomy DNA. Oxidační poškození DNA je jednou z nejčastějších lézí. Cílem této práce bylo prohloubit stávající znalosti molekulárních mechanismů opravy dvojvláknových zlomů DNA a oxidačního poškození DNA. Hlavním zdrojem oxidačního poškození buněk jsou reaktivní formy kyslíku, které jsou neustále generovány jako vedlejší produkty buněčného metabolismu. Jednou z nejčastěji vznikajících modifikací DNA je 7,8-dihydro-8-oxo-guanin (8-oxo-G), jež se během replikace chybně páruje s adeninem. Pokud toto poškození není opraveno, dochází k akumulaci bodových mutací. Oxidační poškození DNA je opravováno převážně vystřižením porušené báze, tzv. „base excision repair“ (BER). Při odstranění špatně inkorporovaného adeninu oproti 8-oxo-G dochází v prvním kroku k jeho vystřižení MutY DNA glykosylázou (MUTYH). Naše výsledky ukazují, že v následném kroku tohoto procesu opravy DNA WRN helikáza (WRN) fyzicky interaguje s polymerázou λ a stimuluje správné přiřazení cytosinu oproti 8-oxo-G a následnou syntézu DNA vedoucí k opravě poškozené DNA. Oprava dvojvláknových zlomů DNA má dvě hlavní větve: homologní rekombinaci (HR) a nehomologní spojování konců (tzv. non-homologous end-joining, NHEJ). Zatímco HR je téměř bezchybný proces, NHEJ je proces vysoce náchylný k chybám. V rámci HR existují dvě paralelní dráhy, a to tzv. „synthesis-dependent strand-annealing“ (SDSA) a kanonická oprava dvojvláknových zlomů DNA (DSBR). Zatímto výsledkem DSBR může být tzv. „crossover“ (CO), kdy dochází k výměně části DNA mezi sesterskými chromatidami, nebo „non-crossover“ (NCO), kdy k této výměně nedochází, v případě SDSA jsou produkty vždy NCO. Tvorba CO je nežádoucí, protože může vést k přesmykům v chromozomech a ztrátě heterozygotnosti. V mitotických buňkách proto většina oprav probíhá mechanismem SDSA. Molekulární podstata procesu, který napomáhá SDSA oproti DSBR není v lidských buňkách dobře prostudována. Lidské helikázy RECQ5 a FBH1 byly navrženy jako funkční orthology Srs2 helikázy, která podporuje SDSA v kvasinkách. Zjistili jsme, že RECQ5 helikáza dokáže zabránit nelegitimní tvorbě RAD51 nukleofilamentu během post-synaptické fáze SDSA a tím podporuje tvorbu NCO produktů. Na základě tohoto zjištění navrhujeme, že funkčním orthologem Srs2 v lidských buňkách je práve RECQ5 helikáza. V kvasinkách existují dvě oddělené dráhy resekce DNA závisející na exonukleáze 1 (Exo1) a Dna2 ve spojení s Sgs1. V lidských buňkách byla navržena Bloom (BLM) helikáza jakožto funkční ortholog Sgs1 helikázy spolupracující s DNA2 v tomto procesu. Naše výsledky ukazují, že DNA2 může spolupracovat v lidských buňkách jak s BLM, tak i s WRN helikázou. Další experimenty naznačují, že BLM helikáza je v tomto procesu vázána v komplexu s TopIIIα-RMI1-RMI2. Aktivace Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) kinázy po indukci dvojvláknových zlomů v buňce je závislá na resekci DNA. Během našeho výzkumu jsme identifikovali MSH2-MSH3 komplex jako součást signální dráhy ATR. Ukázali jsme, že MSH2-MSH3 se váže na konce dvojvláknových zlomů DNA v závislosti na resekci a stimuluje opravu těchto dvojvláknových zlomů DNA homologní rekombinací. Naše výsledky naznačují, že MSH2-MSH3 komplex se váže na sekundární struktury přítomné v jednovláknové DNA i po navázání replikačního proteinu A a rekrutuje ATR-ATRIP komplex, čímž stimuluje aktivaci ATR a opravu DNA.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Cells in our body are challenged every day by DNA damage arising as a result of both endogenous and exogenous insults. The ability of cells to repair DNA lesions is essential for correct propagation of genetic information. The most cytotoxic DNA lesion is DNA double-strand break (DSB) while oxidative DNA damage is one of the most frequent lesions. The aim of this thesis was to improve current the knowledge of the molecular mechanisms underlying the repair of DSBs and oxidative DNA damage. The major source of oxidative damage in cells are reactive oxygen species that are constantly generated as by-products of cell metabolism. One of the most frequent lesions is 7,8- dihydro-8-oxo-guanine (8-oxo-G) that gives rise to 8-oxo-G:A mispairs during DNA replication and if left unrepaired, results in accumulation of DNA mutations. We found that Werner helicase (WRN) physically interacts with DNA polymerase λ (Polλ) and stimulates DNA gap-filling by Polλ opposite to 8-oxo-G followed by strand displacement synthesis in MutY DNA glycosylase homolog (MUTYH) initiated base excision repair (BER) of 8-oxo-G:A mispairs. There are two major pathways involved in repair of DSBs: homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ). NHEJ is highly error-prone while HR is error-free. There are two subpathways of HR, namely synthesis-dependent strand annealing (SDSA) and canonical double strand break repair (DSBR). DSBR results in both crossovers (CO) and non-crossover (NCO) products while SDSA yields only NCOs. Undesired CO formation may lead to chromosomal rearrangements and loss of heterozygosity. Thus, in mitotic cells, majority of HR events proceed via SDSA to avoid crossing-over. The molecular mechanism underlying promotion of SDSA is not well studied in human cells. RECQ5 and FBH1 have been suggested to be functional orthologs of Srs2 helicase that promotes SDSA in yeast cells. We have demonstrated that RECQ5 can prevent illegitimate RAD51 nucleofilament formation during post-synaptic phase of SDSA to promote formation of NCO products. Thus we propose that RECQ5 is the functional ortholog of Srs2 in human cells. In yeast, Exonuclease 1 (Exo1) and Dna2 in conjunction with Sgs1 represent two separate pathways of long-range DNA end resection. In human cells, Bloom helicase (BLM) has been suggested to cooperate with DNA2 to mediate long-range resection. We were able to show that DNA2 cooperates with either BLM or WRN in human cells to mediate this process. In addition, our experiments suggest that BLM promotes DNA end resection in complex with TopIIIα-RMI1- RMI2. Activation of Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) kinase upon DSB induction depends on DNA end resection. We have identified the mismatch recognition complex MSH2- MSH3 as a component of the ATR signalling pathway. We have shown that MSH2-MSH3 is recruited to sites of DSBs in a DNA end resection dependent manner and promotes DSB repair by HR. Moreover, our results suggest that the MSH2-MSH3 complex binds to DNA hairpin structures in replication protein A-coated ssDNA and recruits the ATR-ATRIP complex hence stimulating ATR activation and DNA repair.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Kamila Burdová, Ph.D. 37.56 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Kamila Burdová, Ph.D. 47 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Kamila Burdová, Ph.D. 43 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce RNDr. Kamila Burdová, Ph.D. 831 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Eva Cséfalvay, Ph.D. 592 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Mgr. Lumír Krejčí, Ph.D. 349 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1020 kB