velikost textu

Candida parapsilosis secreted aspartic proteinases: processing and secretion

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Candida parapsilosis secreted aspartic proteinases: processing and secretion
Název v češtině:
Sekretované aspartátové proteasy kvasinky Candida parapsilosis: štěpení prekursoru a sekrece
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Zuzana Vinterová, Ph.D.
Školitel:
Olga Hrušková Heidingsfeldová, Ph.D.
Oponenti:
prof. RNDr. Petr Hodek, CSc.
Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D.
Id práce:
89789
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
4. 6. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
Candida parapsilosis, Saccharomyces cerevisiae, sekretované aspartátové protasy, Sapp1p, SAPP1, Sapp2p, SAPP2, buněčná stěna, biotinylace, štěpení prekursoru, metabolismus dusíku, sekrece
Klíčová slova v angličtině:
Candida parapsilosis, Saccharomyces cerevisiae, secreted aspartic proteinases, Sapp1p, SAPP1, Sapp2p, SAPP2, cell wall, biotinylation, proteolytic activation, nitrogen metabolism, secretion
Abstrakt:
Abstrakt Candida parapsilosis je lidský oportunní patogen, jehož klinický význam vzrůstá, a který způsobuje širokou škálu potencionálně život ohrožujících infekcí u jedinců s oslabeným imunitním systémem. Jedním z nejvýznamějších virulenčních faktorů kvasinek Candida je produkce sekretovaných aspartátových proteas (Saps). Předkládaná disertační práce se zabývá převážně studiem sekretované aspartátové proteasy 1 (Sapp1p) kvasinky C. parapsilosis, jejím procesem aktivace a sekrece za různých podmínek a s využitím různých experiemntálních modelů. Sapp1p je sekretovaná buňkami C. parapsilosis do mimobuněčného prostoru se zcela odštěpeným pre-pro-peptidem a plně proteolyticky aktivní. Pokusy studující buněčnou stěnu C. parapsilosis prokázaly prodlouženou přítomnost zcela aktivované proteasy na buněčném povrchu (CW-Sapp1p). Metoda pro měření enzymové aktivity Sapp1p provedená na neporušených buňkách ukázala, že CW-Sapp1p je proteolyticky aktivní ještě před svým uvolněním do mimobuněčného prostoru a je schopná štěpit substrát. Pokusy s biotinylací a následnou analýzou pomocí hmotnostní spektrometrie ukázaly, že biotinylace CW-Sapp1p je proces saturovatelný, jehož výsledkem ale nejsou plně naznačené molekuly. Přístupnost jednotlivých lysinových zbytků byla v molekule Sapp1p proměnlivá s výjimkou čtyř zbytků, které byly naznačené ve všech našich pokusech. Poslední krok sekrece proteinu tak nutně nemusí být náhodný proces. Sekrece a štěpení zymogenu Sapp1p byly dále studovány v kex2Δ mutantních buňkách S. cerevisiae. Exprese SAPP1 vedla k sekreci Sapp1p s N-koncem prodlouženým o 39 aminokyselin, která byla identifikována jako pro-Sapp1p. Sekretovaná pro-Sapp1p nebyla okamžitě autoaktivovaná v kyselém prostředí, tak jako v případě rekombinantního zymogenu Sapp1p získaného z buněk E. coli. Konečně, pokusy s expresí SAPP1 řízené vlastním promotorem pSAPP1 v buňkách divokého kmene S. cerevisiae ukázaly sekreci plně aktivované Sapp1p spolu s jejím prekursorem při kultivaci buněk v přítomnosti proteinu jako jediného zdroje dusíku. Narozdíl od sekrece buňkami C. parapsilosis byla proteasa sekretovaná také buňkami kultivovanými v přítomnosti sulfátu amonného jako jediného zdroje dusíku. Zatěchto podmínek jsme však nepozorovali sekreci prekursoru. Přestože promotor pSAPP1 nevykazoval známky propojení s regulační sítí S. cerevisiae, real- time PCR analýza prokázala změny v míře exprese SAPP1 v buňkách v závislosti na druhu zdroje dusíku, což přeci jen naznačuje nějakou míru regulace.
Abstract v angličtině:
Abstract Candida parapsilosis is an emerging human opportunistic pathogen causing a wide spectrum of potentially life-threatening infections in immunocompromised hosts. One of the most important virulence factors of Candida spp. is a production of secreted aspartic proteinases (Saps). Presented thesis is mainly focused on the study of secreted aspartic proteinase 1 (Sapp1p) of C. parapsilosis, its processing and secretion under variable conditions and by use of various experimental models. Sapp1p is secreted by C. parapsilosis cells into the extracellular space as a completely processed and fully active enzyme. Experiments studying the C. parapsilosis cell wall (CW) confirmed the prolonged presence of completely processed Sapp1p on the cell surface (CW- Sapp1p). Proteolytic activity assay performed with the intact cells showed that CW-Sapp1p is proteolytically active prior to its release into the extracellular space and is capable of substrate cleavage. Biotinylation experiments with consecutive MS analysis revealed that CW-Sapp1p biotinylation is incomplete but saturable process, leaving partially unlabelled molecules. The accessibility of individual lysine residues in the Sapp1p molecule varied, with exception of four residues that were labelled in all of our experiments performed. The final step of Sapp1p secretion may not be a completely random process. Secretion and processing of Sapp1p were further studied in kex2Δ mutant S. cerevisiae cells. SAPP1 expression resulted in a secretion of Sapp1p flanking 39 amino acids on the N- terminus which was identified as pro-Sapp1p. Secreted pro-Sapp1p was not as readily autoactivated in acidic conditions as recombinant zymogen of Sapp1p produced in E. coli. Finally, experiments with the expression of SAPP1 driven by its own pSAPP1 promoter in S. cerevisiae wt cells resulted in a secretion of fully processed Sapp1p together with its precursor in the presence of protein as a sole source of nitrogen in the cultivation media. Unlike in C. parapsilosis cells, Sapp1p was secreted also by S. cerevisiae cells in the presence of ammonium sulphate as a source of nitrogen. In this case, no precursor of Sapp1p was secreted alongside. Despite the fact that pSAPP1 seemed disconnected from regulatory network of S. cerevisiae, real-time PCR analysis confirmed differences in SAPP1 expression levels which depended on the source of nitrogen used in the cultivation media, suggesting some sort of regulation after all.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Zuzana Vinterová, Ph.D. 3.28 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Zuzana Vinterová, Ph.D. 138 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Zuzana Vinterová, Ph.D. 60 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Zuzana Vinterová, Ph.D. 1.4 MB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Petr Hodek, CSc. 221 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. Ing. Barbora Szotáková, Ph.D. 345 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1.03 MB