velikost textu

Liquid chromatography methods for analysis of microbial secondary metabolites of bioactive nature

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Liquid chromatography methods for analysis of microbial secondary metabolites of bioactive nature
Název v češtině:
Metody kapalinové chromatografie pro analýzu biologicky aktivních mikrobiálních sekundárních metabolitů
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Tereza Tylová, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Jana Olšovská, Ph.D.
Oponenti:
doc. RNDr. Josef Cvačka, Ph.D.
doc. RNDr. Dr. David Sýkora
Konzultanti:
prof. RNDr. Eva Tesařová, CSc.
doc. RNDr. Zuzana Bosáková, CSc.
Id práce:
89591
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra analytické chemie (31-230)
Program studia:
Analytická chemie (P1403)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
9. 4. 2013
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
ABSTRAKT (CZ) Tato disertační práce je zaměřena na vývoj nových analytických metod sestávajících z extrakce tuhou fází (SPE) použité pro purifikaci a zkoncentrování analytů a jejich stanovení pomocí ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie (UHPLC) s detektorem diodového pole (DAD) a/nebo hmotnostní detekcí za použití analyzátoru doby letu (ToFMS). Většina předkládaných výsledků byla publikována v prestižních mezinárodních časopisech. Součástí práce jsou také významná dosud nepublikovaná data. Kromě modelových srovnání různých typů kolonových materiálů pro ultra-vysokoúčinné separace představuje práce také významné aplikace vyvinutých metod. Zatímco první část práce je věnovaná stanovení antibiotik jakožto kontaminantů životního prostředí zodpovědných za vývoj a šíření bakteriální rezistence, druhá část se věnuje analýze a hledání biologicky aktivních sekundárních metabolitů z přírodních zdrojů, které mohou být v budoucnu využity jako nová antibiotika. První část disertační práce je zaměřena na stanovení reziduálních antibiotik v různých matricích (prasečí mrva, odpadní voda, povrchová voda). Jako analyty byla vybrána nejpoužívanější humánní a veterinární antibiotika. Metody sestávající z UHPLC-DAD a UHPLC-ToFMS a dále z SPE nebo extrakce kapalina-kapalina (LLE) byly validovány a pro kvantifikaci byly vybrány vhodné kalibrační techniky. Vyvinuté metody byly použity pro analýzu reálných vzorků z různých lokalit České republiky a výsledky odhalily přítomnost antibiotik ve většině z nich. Prasečí mrva obsahovala tetracyklinová antibiotika v koncentracích až 6 mg kg-1. Všechny testované vzorky vod byly pozitivní na antibiotika s naměřenými koncentracemi pohybujícími se od 5 ng L-1 do 1290 ng L-1. Druhá část této práce je zaměřena na vývoj analytických metod určených pro studium sekundárních metabolitů produkovaných houbami rodu Geosmithia. U těchto hub se předpokládá možnost jejich charakterizace na základě produkce sekundárních metabolitů. Jakožto symbionti jsou tyto houby jsou navíc potenciálním zdrojem biologicky aktivních sekundárních metabolitů. Byla vyvinutá nová UHPLC-DAD-ToFMS metoda pro „chromatografický fingerprinting“ extracelulárních metabolitů ve fermentačním médiu těchto hub a následně byla použita pro analýzu 48 kmenů rodu Geosmithia. Pro extrakci analytů byly testovány různé SPE sorbenty a postupy pro LLE s výsledným použitím silného měniče kationtů (Oasis MCX). Výsledky odhalily silnou korelaci mezi „UHPLC-DAD-ToFMS fingerprinty“ a taxonomickou příslušností jednotlivých kmenů. Tyto dosažené výsledky potvrzují, že vyvinutá metoda je vhodná pro účely „chromatografického fingerprintingu“ založeného na analýze produkovaných houbových sekundárních metabolitů. Dále byly vyvinuty UHPLC-DAD-ToFMS a HPLC-UV metody pro následný „chromatografický screening“ biologicky aktivních sekundárních metabolitů těchto hub. U testovaných kmenů byla zjištěna produkce sekundárních metabolitů se širokým antimikrobiálním spektrem účinnosti a tyto látky byly vyvinutými metodami určeny. Tím bylo potvrzeno, že vyvinuté LC metody jsou vhodné pro „chromatografický screening“ biologicky aktivních sekundárních metabolitů a že houby rodu Geosmithia představují slibný zdroj zajímavých antimikrobiálních látek. Třetí část práce se zabývá možnými přístupy vedoucími ke zvýšení účinnosti a rychlosti chromatografických separací při analýze mikrobiálních sekundárních metabolitů. Byla srovnávána nedávno představená kolona obsahující povrchově porézní částice (reprezentované Kinetex C18 kolonou) s kolonou s plně porézními částicemi (reprezentovány Acquity BEH C18 sub-2µm particle kolonou) na UHPLC systému za použití mobilní fáze o kyselém i zásaditém pH. Bylo zjištěno, že kolona Kinetex C18 je vhodnou alternativou Acquity BEH C18 kolony. Velkou výhodou kolony Kinetex C18 je její nižší zpětný tlak, což umožňuje její použití na běžném HPLC chromatografu. Nicméně byla zjištěna limitace Kinetex C18 kolony v podobě její omezené stability v alkalické oblasti pH.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT (EN) This work is focused on development of new analytical methods involving modern solid phase extraction (SPE) for sample purification and pre-concentration, state-of-art ultra high- performance liquid chromatography (UHPLC) for separation of analytes and detection using diode-array detection (DAD) and/or time-of-flight mass spectrometry (ToFMS). The major part of the results has been published in prestigious international journals. The relevant yet unpublished results are included in the thesis as well. Besides a model comparison of various column chemistries used for “ultra-high performance” separations, some meaningful applications were developed. While one part of applications deal with determination of antibiotics as environmental contaminants that are responsible for the development and spread of microbial resistance, the second part is concerned with analyzing and finding of potential natural source of novel antimicrobial agents that can be further used as new antibiotics. The first part of the thesis was focused on the determination of residual antibiotics in different matrices (liquid hog manure, wastewater, surface water). The mostly prescribed antibiotics in both human and veterinary medicine were chosen as analytes in this study employing analytical methods consisting of UHPLC-DAD and UHPLC-ToFMS together with SPE or liquid-liquid extraction (LLE). The methods were validated and the proper calibration techniques were employed for quantification. The developed procedures were applied for analysis of real environmental samples from different localities in the Czech Republic and the results revealed the occurrence of antibiotics in the majority of the tested samples. The liquid hog manure was positive for tested tetracyclines at concentrations up to 6 mg kg-1. All tested water samples were positive for studied antibiotics at concentrations ranging from 5 ng L-1 to 1290 ng L-1. The second part of the thesis was focused on development of analytical methods useful for study of secondary metabolites produced by fungi of genus Geosmithia. The probability of the employment of the secondary metabolites´ production for the characterization of these fungi was expected. Moreover, these symbionts represent the potential reservoir of bioactive secondary metabolites with various antimicrobial activities. A new UHPLC-DAD-ToFMS method was developed for chemical fingerprinting of extracellular secondary metabolites in fermentation broth of these fungi and was applied for analysis of 48 Geosmithia strains. Various SPE chemistry and LLE procedures were tested resulting in employment of strong cation-exchange mixed-mode polymeric sorbent (Oasis MCX) for extraction of secondary metabolites. Strong correlation between the UHPLC-DAD-ToFMS fingerprints and the taxonomical identity of Geosmithia spp. was revealed. These results qualify the method as a chromatographic fingerprinting tool for characterization of fungal strains based of the analysis of their secondary metabolites. The subsequent chromatographic screening for bioactive secondary metabolites employed both UHPLC-DAD-ToFMS and HPLC-UV methods. Among the tested strains, the secondary metabolites characterized by wide antimicrobial spectrum were revealed and these compounds were determined using the developed analytical methods. This fact confirmed that the introduced LC methods represent a useful tool for the chromatographic screening for bioactive secondary metabolites and that the Geosmithia fungi are promising reservoir of interesting antimicrobial compounds. The third part of the thesis was aimed on the approaches how to improve the efficiency and speed of analysis of microbial secondary metabolites. The recently introduced columns packed with superficially porous particles (represented by Kinetex C18 column) were tested and compared with fully porous particles (represented by Acquity BEH C18 sub-2µm particle column) in UHPLC system under both acidic and alkaline conditions using gradient elution program. The Kinetex C18 column was found to be a suitable alternative to Acquity BEH C18 column. The great advantage of the Kinetex C18 column is the lower column backpressure that enables its use on conventional LC system. However, the limitation of employment of Kinetex C18 column under alkaline conditions was observed with respect to its decreasing performance with the growing number of injections on the column.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Tereza Tylová, Ph.D. 2.54 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Tereza Tylová, Ph.D. 22 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Tereza Tylová, Ph.D. 11 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Josef Cvačka, Ph.D. 165 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Dr. David Sýkora 110 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1.05 MB