velikost textu

Studium metabolizmu v in vitro kulturách Cannabis sativa L.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium metabolizmu v in vitro kulturách Cannabis sativa L.
Název v angličtině:
Study of the Metabolism in in Vitro Cultures of Canabis Sativa L.
Typ:
Disertační práce
Autor:
PharmDr. Jaroslav Peč, Ph.D.
Školitel:
Doc.RNDr. Jaroslav Dušek, CSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Daniel Grančai, CSc.
Prof. RNDr. Václav Suchý, DrSc.
Id práce:
88671
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakognozie (16-16180)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Farmakognosie (DFG)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
24. 6. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
I. Závěr Z dostupných informačních zdrojů byl vypracován přehled obsahových látek rostliny Cannabis sativa L. se zaměřením na jejich biologickou aktivitu. Dále bylo zpracováno téma biotechnologické kultivace tkáňových kultur a aplikace moderních instrumentálních analytických metod v rámci rozvíjející se disciplíny metabolomiky. Na základě NMR a MS výsledků nebyly detekovány kanabinoidy v kontrolních nebo elicitovaných suspenzních kulturách Cannabis sativa L.. Také ostatní sekundární metabolity nebyly zaznamenány pomocí NMR. Pro úplné vyhodnocení ostatních sekundárních metabolitů, pokud byly přítomny, by bylo nezbytné využít citlivější analytické metody a jejich kombinace. Lze shrnout, že v suspenzních, kalusových a embryonálních kulturách Cannabis sativa L. nebyla s využitím elicitace pektinem nebo jasmonovou kyselinou stimulována biosyntéza kanabinoidů. Na základě kvantifikace produkovaných sloučenin a sestrojených růstových křivek byly vyhodnoceny metabolity jednotlivých růstových fází. S využítím statistické metody PCA byly vyhodnoceny důsledky elicitací s návazností na identifikaci případně objasnění struktury 1H metabolitů. Bylo identifikováno maximum možných signálů NMR spekter a objasněny struktury u neznámých sloučenin s využitím 2D NMR. Výsledky získané z NMR měření a PCA analýz předkládají ucelený obraz primárního metabolizmu kultur, který však pravděpodobně nesměřuje v biosyntetických drahách ke složitějším strukturám sekundárních metabolitů. Jednoznačně byl elicitací aktivován metabolizmus kyseliny šikimové vedoucí k aromatickým stavebním kamenům, který ovšem není součástí metabolické dráhy kanabinoidů. Na druhou stranu detekce signálů typických pro terpenové metabolity v choroformové frakci dokládá aktivitu deoxyxylulózové a mevalonátové metabolické cesty vedoucí k C5 isoprenovým jednotkám. Jednou z důležitých podmínek pro produkci sekundárních metabolitů je ovšem také kompartmentizace v rostlině, která může být u nediferencovaných buněčných kultur překážkou v úspěšnosti experimentu. V případě konopí je důležitou podmínkou tvorba specializovaných žlaznatých trichomů, ve kterých dochází k odblokování nezbytných enzymových systémů biosyntézy. Takto lze předpokládat, že i při dostatečném zásobení stavebními kameny nezbytnými pro kanabinoidní strukturu, není aktivován již brzský enzymový systém biosyntézy kanabinodů představovaný olivetol syntázou a nedochází k tvorbě prekurzoru olivetolové kyseliny. Ve stádiu výzkumů zůstává také charakterizace dalších izoforem polyketidsyntáz, které mohou zajišťovat jak biosyntézu kanabinoidů, tak přesmykovat metabolickou dráhu na jiné sekundární metabolity např. flavonoidy nebo stilbenoidy s využitím stavebních kamenů acetátového metabolizmu 257). Předloženou analýzou byl důkladně prozkoumán metabolizmus suspenzních kultur a NMR záznamy budou sloužit pro další experimenty s daným biologickým materiálem. Nedílnou součástí bude dále porovnání s extrakty intaktních rostlin, které představují z hlediska NMR analýzy nesrovnatelně složitější systém, který bude však s využitím údajů uvedených v této práci jednodušeji interpretovatelný. Uvedená data jsou také nezbytná pro další experimenty molekulárně biologického zaměření, zejména v dalších výzkumech týkajících se brzských stádií metabolické dráhy kanabinoidů, jmenovitě studia polyketid syntáz 258).
Abstract v angličtině:
I. Summary The literature review concerning Cannabis sativa L. was prepared with focus on the biologically active compounds. The scope of cell cultures biotechnology and application of modern instrumental analytical methods in the field of metabolomics was discussed. Based on the NMR and MS results, no cannabinoids were detected in the control or elicited cell suspension cultures of Cannabis sativa L. Also other secondary metabolites were not detected by NMR. Other more sensitive analytical methods and their combinations should be used for absolute evaluation of other secondary metabolites, if they are present. It can be concluded, that biosynthesis of the cannabinoids was not induced by pectin or jasmonic acid as elicitors in the suspension, callus or embryogenic tissue cultures of Cannabis sativa L. Main metabolites of certain growt phases were evaluated based on the quantification of produced metabolites and prepared growth phase curves. The impacts of elicitations were interpreted by PCA statistical method, with subsequent metabolite identification or structure 1H elucidation. Maxima of possible NMR signals were identified and 2D NMR experiments were applied for signals of unknown compounds. The results from NMR measurements combined with PCA analysis brought comprehensive picture of the cultures’ primary metabolism, which is not however directed throught biosynthetic pathways to the complex structures of secondary metabolites. Unambiguously was induced metabolism of shikimic acid pathway leading to the aromatic building stones, which are indeed not part of the cannabinoids metabolism. On the other hand detection of terpene signals in chloroform fraction is proof of deoxyxylulose and mevalonate metabolic pathways leading to C5 isoprene units. Compartmentization is also one of the major requirements for secondary metabolites production, which can be handicap of successful experiment in case of the nondiferentiated cell cultures. For cannabis the presence of glandular trichomes with specific enzymatic apparatus is necessary condition. Based on this knowledge we can expect that even with sufficient supply of the cannabinoids biosynthetic building stones, the necessary enzymatic apparatus representing by olivetolic synthase is not activated in early stages and therefor olivetolic acid as major precursor is not synthetized. In the field of research also remains characterization of other polyketide synthase izoforms, which could be involved in the biosynthesis of cannabinoids or rearrange metabolic pathway to the other secondary metabolites using acetate as building block like flavonoids or stilbenoids 257). By our analysis was comprehencively studied metabolism of the suspension cultures and achieved NMR results will be used in next experiments with the biological material. Integral part will be comparison of the data with intact plant extracts, which represent 1H distinctively much more complex system from the NMR analysis point of view. Our data will be used in subsequent experiments of chemical or molecular biology way, especially concerning early stages of cannabinoids metabolism, namely in the study of polyketide synthase izoforms 258).
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce PharmDr. Jaroslav Peč, Ph.D. 9.17 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce PharmDr. Jaroslav Peč, Ph.D. 193 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky PharmDr. Jaroslav Peč, Ph.D. 128 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Doc.RNDr. Jaroslav Dušek, CSc. 72 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Daniel Grančai, CSc. 172 kB
Stáhnout Posudek oponenta Prof. RNDr. Václav Suchý, DrSc. 86 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby Prof. RNDr. Luděk Jahodář, CSc. 79 kB