velikost textu

The study of the influence of vitamin E analogues on malignant mesothelioma

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
The study of the influence of vitamin E analogues on malignant mesothelioma
Název v češtině:
Studium vlivu analogů vitamínu E na maligní mezoteliom
Typ:
Disertační práce
Autor:
Jaromíra Kovářová, Ph.D.
Školitel:
prof. Ing. Jiří Neužil, CSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Alois Kozubík, CSc.
prof. MUDr. Libor Vítek, Ph.D.
Id práce:
87823
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
24. 9. 2013
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
Analogy vitamínu E, cílení do mitochondrií, kyslíkové radikály, komplexy dýchacího řetězce, apoptóza, rakovina, maligní mezoteliom, septiny
Klíčová slova v angličtině:
Vitamin E analogues, mitochondrial targeting, reactive oxygen species, respiratory complexes, apoptosis, cancer, malignant mesothelioma, septins
Abstrakt:
Souhrn Rakovina je nejčastější příčinou smrti v západním světě a frekvence jejího výskytu stále stoupá. Přestože k dnešní době došlo k výraznému zlepšení v diagnostice a přístupu k léčbě, mnoho typů rakoviny je stále letální díky nedostatečné radikální terapii. Jedním z fatálních neoplastických druhů této choroby je maligní mezoteliom (MM). MM je charakterizován vysokou úmrtností a limitovanými terapeutickými možnostmi. Etiologie tohoto onemocnění je především spojována s inhalací azbestových vláknen. Výskyt MM se zvyšuje v mnoha zemích; proto je velmi důležité hledat nová molekulární zásahová místa, protirakovinné strategie a léčiva, která by výrazně pomohla zkvalitnit terapii. Určitá nová léčiva, především ta, která mají specifické molekulární cíle a vykazují se vysokou selektivitou pro rakovinné buňky, významně zvýšila úspěšnost léčby některých druhů rakoviny. Velmi slibný molekulární cíl pro protirakovinné látky tvoří mitochondrie. V posledních letech se výzkum zaměřil na skupinu protirakovinných sloučenin, zvaných ‘mitokany’, které indukují apoptózu v rakovinných buňkách mitochondriální destabilizací. Bylo publikováno, že některé mitokany vyvolávají apoptózu selektivně v rakovinných buňkách a inhibují růst mnoha druhů karcinomu v preklinických modelech. Cílem této doktorské práce bylo studium proapoptotického vlivu mitokanů ze skupiny derivátů vitamínu E, reprezentovaných α-tokoferylsukcinátem (α-TOS) a jeho modifikovanou formou - mitochondriálně cíleným analogem vitamín E sukcinátu (MitoVES) na MM buňky. MM buňky byly vybrány pro testování zmíněných látek kvůli agresivnímu charakteru této rezistentní formy rakoviny. Oba analogy vitamínu E byly známy již z předchozích studií pro jejich schopnost indukovat apoptózu v rakovinných buňkách a potlačovat růst mnoha druhů rakoviny v preklinických modelech. Na molekulární úrovni působí tyto látky jako BH3 (Bcl-2 homology domain-3) mimetika, která zvyšují citlivost rakovinných buněk vůči jiným protirakovinným léčivům. Oba mitokany indukují apoptózu zasažením mitochondriálního komplexu II (CII) elektronového redoxního řetězce. Přitom interferují s ubichinonem, přirozeným akceptorem elektronů, vzniklých aktivitou sukcinátdehydrogenázy CII elektronového transportního řetězce během přeměny sukcinátu na fumarát. Tok elektronů je tímto způsobem přerušen a dochází k tvorbě kyslíkových radikálů, které difundují do cytoplazmy ve formě peroxidu vodíku a které jsou následně přeměněny na více reaktivní typy radikálů, katalyzující aktivaci proapoptotických proteinů, konkrétně oligomerizaci proteinů Bax nebo Bak. Následkem této oligomerizace je vytvoření multimérního kanálu v mitochondriální vnější membráně. Tímto kanálem dochází k uvolnění cytochromu c do cytosolu a následné aktivaci mitochondriální apoptotické dráhy. Na rozdíl od prototypického analogu vitamínu E, α-TOSu, je MitoVES modifikován trifenylfosfóniovou skupinou (TPP+), která je zásadní pro cílené ukotvení a akumulaci této látky v mitochondriální vnitřní membráně rakovinné buňky a zajišt’uje tak mnohem silnější apoptotickou účinnost látky. Tato práce ukazuje, že MitoVES je výrazně účinnější v zabíjení MM buněk ve srovnání s α-TOSem s hodnotami IC50 nižšími až o dva řády. Dále je v práci dokumentována akumulace MitoVESu v mitochondriích MM buněčných liniích pomocí konfokální mikroskopie a fluorescenčně označeného analogu MitoVESu. Zkracování alifatického řetězce MitoVESu, které spojuje skupinu TPP+ a chromanolovou část molekuly, vede ke snížení účinnosti látky. Toto pozorování indikuje, že mitochondriální CII by mohl být cílem působení MitoVESu. Úloha CII v aktivitě MitoVESu byla dále potvrzena tím, že MM buňky s inhibovanou sukcinát-ubichinonreduktázou byly rezistentní vůči této látce. V dalších experimentech indukoval MitoVES apoptózu v MM buněčných liniích mitochondriální destabilizací, což se projevilo poklesem mitochondriálního membránového potenciálu a tvorbou volných kyslíkových radikálů. Výrazně vyšší anti- mezoteliomální aktivita MitoVESu nad α-TOSem byla také prokázána na myším modelu. Všechna data, získaná v tomto projektu dokazují, že cílení vitamín E sukcinátu do mitochondrií a dopravení k molekulárnímu zásahovému místu působení obdařuje tuto látku výrazně vyšší schopností zabíjet MM buňky. Další část této doktorské práce zahrnuje proteomickou a genomickou studii vlivu α-TOSu na MM buňky. Pomocí 2-rozměrné gelové elektroforézy a hmotnostní spektrometrie bylo identifikováno několik proteinů se zvýšenou či sníženou expresí po působení zmíněného derivátu vitamínu E na MM buňky. Rozdílnou expresi některých z těchto proteinů či jejich kódujících genů se podařilo potvrdit jinými technikami, zahrnujícími RT-PCR, real-time kvantitativní RT-PCR a western blot. Zaměřili jsme se na cytoskeletální protein septin 11, který byl identifikován všemi zmíněnými metodami jako snížený po působení α-TOSu. V následujících experimentech se však nepodařilo utlumit gen, kódující protein septin 11. Z důvodu blížících se klinických testů plánovaných naší laboratoří bylo nezbytné zaměřit se na část projektu popsanou výše, tj. mechanismus zabíjení MM buněk MitoVESem. Přesto však má význam, sledovat a dokončit tento druhý projekt, jelikož získané výsledky mají velice zajímavou podstatu. Jak je známo z dřívější literatury, septin 11 a některé další identifikované proteiny hrají důležitou roli při různých funkcích, zahrnujících regulaci apoptózy, buněčné proliferace, karcinogeneze a tvorby metastáz. Proto je plánováno, že tato část projektu bude dokončena v následující studii v naší laboratoři Tato práce je v kontextu s potenciální léčbou MM, který je doposud smrtelným onemocněním. Vědecky vzato mohou výsledky získané v této práci přispět ke vznikající nadějné představě, že mitokany mohou být vyvinuty v efektivní protirakovinná léčiva, která budou použita za účelem omezení rostoucího výskytu neoplastických onemocnění, jako je zde představený, velmi složitě léčitelný mezoteliom.
Abstract v angličtině:
Abstract Cancer is a leading cause of death in the western world and is increasing in frequency world-wide. Although diagnosis, treatment and therapeutic approaches to cancer have improved, many types of cancer are still lethal due to the lack of radical treatment. One of the fatal neoplastic disease types with poor prognosis is represented by malignant mesothelioma (MM). MM is characterised by very high mortality rate and limited therapeutic options. The etiology of the disease is mainly associated with exposure to asbestos fibres. The incidence of MM is increasing in many countries. The search for novel molecular targets, anti-cancer strategies and drugs, which would considerably improve the treatment is of great importance. Certain new drugs, especially those with specific molecular targets, show high selectivity in their action to cancer cells, and have considerably increased the cure rate in some types of cancer. Mitochondria have recently emerged as a very promising target for anti-cancer agents. A group of compounds with anti-cancer activity that induce apoptosis by way of mitochondrial destabilisation, termed ‘mitocans’, have been a recent focus of research. Several mitocans have been shown to selectively induce apoptosis in cancer cells and suppress the growth of many types of carcinomas in pre-clinical models. The aim of this PhD thesis was to study the pro-apoptotic effect of mitocans from the group of vitamin E analogues epitomised by the redox-silent α-tocopheryl succinate (α-TOS) and its modified form, mitochondrially targeted analogue of vitamin E succinate (MitoVES) on MM cells. The experiments were performed on MM cells due to the very aggressive nature of this treatment-resistent cancer. Both vitamin E (VE) analogues were known from previous studies to selectively induce apoptosis in cancer cells and suppress the growth of many types of carcinomas in pre-clinical models. At the molecular level they act as Bcl-2 homology domain 3 (BH3) mimetics and sensitise cancer cells to other drugs. More importantly, they induce apoptosis by affecting the mitochondrial complex II (CII) of the electron redox chain. Thereby they interfere with ubiquinone, the natural acceptor for electrons generated by the succinate dehydrogenase activity of CII during conversion of succinate to fumarate. The electron flow is disrupted and reactive oxygen species (ROS) are formed. These ROS diffuse into cytoplasm in the form of hydrogen peroxide and are converted into more reactive radical species that catalyse activation of the pro-apoptotic proteins, viz. oligomerisation of Bax or Bak, resulting in the formation of a megachannel in the mitochondrial outer membrane. This leads to the translocation of cytochrome c into cytosol via the channel, and the downstream mitochondrial pathway of apoptosis is initiated. In contrast to the untargeted prototypic VE analogue α-TOS, MitoVES has been modified with a triphenyphosphonium (TPP+) group, which is important for the directed docking and accumulation of the compound in the mitochondrial inner membrane of a cancer cell, providing a much stronger apoptogenic efficacy. In this work, it has been demonstrated that MitoVES is significantly more efficient in killing MM cells than α-TOS with IC50 lower by up to two orders of magnitude. Further, the mitochondrial accumulation of MitoVES in MM cells has been proved by confocal microscopy using its fluorescently tagged analogue (MitoVES-F). Shortening the aliphatic chain of MitoVES spanning the chromanol and TTP+ groups has reduced the efficacy of the agent, suggesting that its possible target might be the mitochondrial CII. The function of CII in the activity of MitoVES has been cofirmed, as MM cells with suppressed succinate quinone reductase were resistant to the agent. Further, MitoVES has induced apoptosis in MM cells via mitochondrial destabilisation, resulting in the decrease of mitochondrial membrane potential and generation of ROS. A mouse model has been used to show the superior anti-MM activity of MitoVES to α-TOS. All data obtained within this work have proven that mitochondrial targeting of vitamin E succinate endows the agent with considerably higher efficacy to kill MM cells, bringing it to the vicinity of its molecular target. Another part of this PhD project involves a proteomic and genomic study of the influence of α-TOS on MM cells. Using 2-dimensional gel electrophoresis, a variety of up- or down- regulated proteins have been identified after the treatment of MM cells with the VE analogue. Some of these proteins have been confirmed by other techniques, including RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR and western blot. We have focused on the cytoskeletal protein septin 11, which has been found to be down-regulated after the treatment with α-TOS by all used techniques. Unfortunatelly, the subsequent gene silencing experiments have failed. Due to the oncoming clinical trials (planned by our laboratory), there was a need to focus more on the project described above, i.e. the mechanims of killing of MM cells by MitoVES. Notwithstanding this focus, it is worth to complete the second part of this project, as the obtained results seem to be very interesting since septin 11 and the several other identified proteins have been described by previous studies to play important roles in a variety of functions of (cancer) cells, including regulation of apoptosis, cell proliferation, carcinogenesis and metastasis. It is planned that this part of the project will be completed in a follow up study in our laboratory. The context of this work is within the potential cure of MM, a thus far fatal disease. Scientifically, it is believed that the acquired outcomes from this work will contribute to the emerging notion that mitocans hold a substantial promise to be developed into efficient anti-cancer drugs that will be utilised to help curb the increasing incidence of neoplastic diseases, as epitomised here by the extremely hard-to-treat mesothelioma.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Jaromíra Kovářová, Ph.D. 2.86 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Jaromíra Kovářová, Ph.D. 27 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Jaromíra Kovářová, Ph.D. 21 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Alois Kozubík, CSc. 2.28 MB
Stáhnout Posudek oponenta prof. MUDr. Libor Vítek, Ph.D. 78 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 920 kB