velikost textu

Structural and functional characterization of yeast plasma membrane domains

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Structural and functional characterization of yeast plasma membrane domains
Název v češtině:
Charakterizace strukturně-funkčních domén v plasmatické membráně kvasinek
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Vendula Strádalová, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Jan Malínský, Ph.D.
Oponenti:
prof. RNDr. Zdena Palková, CSc.
doc. RNDr. Ivo Konopásek, CSc.
Id práce:
87817
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
6. 9. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
ABSTRAKT Plazmatická membrána (PM) všech buněk hostí celou řadu důležitých buněčných funkcí. Tyto funkce musí být pečlivě koordinovány, a jak současný výzkum ukazuje, plazmatická membrána je za tímto účelem uspořádána do specializovaných domén. Naše laboratoř se zabývá výzkumem způsobu organizace plazmatické membrány u kvasinky pivní, kde bylo za použití fluorescenční mikroskopie popsáno několik nepřekrývajících se domén. Jednou takovou doménou je MCC (Membrane Compartment occupied by transporter Can1), která je tvořena stabilními izolovanými oblastmi PM o velikosti asi 300 nm. MCC domény obsahují několik přenašečů a proteinů o neznámé funkci (proteiny příbuzné Sur7 a Nce102) a jejich formování je organizováno z cytosolu proteinovými komplexy zvanými eisosomy, jež jsou tvořeny především proteiny Pil1 a Lsp1. Tato práce navazuje na studie, které měly za cíl objasnit složení, strukturu a funkci MCC. V první části práce jsme se zaměřili na ultrastrukturální analýzu MCC, přičemž jsme nejdříve vyvinuli protokol pro transmisní elektronovou mikroskopii (TEM), který dobře zachovává strukturu PM. Zjistili jsme, že mrazová fixace pomocí vysokotlakého zamražení, kombinovaná s mrazovou substitucí a zalitím vzorku do pryskyřice za nízké teploty, vede k výrazně lepšímu zachování buněčné struktury a vyššímu signálu při imunoznačení než při použití chemických fixativ. Tyto poznatky jsme využili v hlavní části práce, která prokázala, že MCC domény odpovídají žlábkovým invaginacím v plazmatické membráně kvasinek, tedy strukturám pozorovaným již před téměř 50 lety pomocí mrazového lámání. My jsme ukázali, že kmeny nce102 a pil1, ve kterých jsou MCC domény poškozené či chybí, tyto žlábkové invaginace postrádají. A naopak, kmen mak3, ve kterém jsme pozorovali abnormálně prodloužené MCC domény, měl odpovídajícím způsobem prodloužené žlábkové invaginace. Detekce proteinů Sur7 a Pil1 pomocí protilátek pro TEM pak jednoznačně prokázala lokalizaci obou proteinů do oblastí žlábkových invaginací. Jelikož jsme ukázali, že protein Nce102 je důležitý regulátor MCC domén, zaměřili jsme se dále na objasnění jeho role v upořádání MCC. Naše analýza nepotvrdila předpoklad, že Nce102 vlastní 4 transmembránové domény, ale spíše ukázala, že Nce102 zaujímá v membráně konformaci tzv. vlásenky (hairpin). Toto uspořádání by mohlo pomoci objasnit způsob zapojení Nce102 do tvorby žlábkové invaginace. Ukázali jsme rovněž, že blízcí i vzdálení příbuzní proteinu Nce102 mohou zastoupit Nce102 v jeho roli při umisťování proteinu Can1 do MCC, což nás vedlo k závěru, že proteiny podobné Nce102 mají pravděpodobně stejnou funkci u všech druhů v kmeni Ascomycota. Poslední část této disertační práce byla inspirovaná naším pozorováním, že MCC se nepřekrývá s hustou sítí kortikálního ER, jež se rozprostírá v těsné blízkosti plazmatické membrány. Delece Pil1, hlavního organizátoru MCC/eisosome, vedla k abnormálnímu rozmístění kortikálního ER pod membránou. Jelikož jsme zároveň zjistili, že kortikální ER přesměrovává vezikulární transport do oblastí plazmatické membrány nepokryté ER, je jasné, že: 1) kortikální ER přispívá k funkční organizaci plazmatické membrány a 2) MCC se tohoto funkčního rozdělení PM také účastní díky svému vlivu na distribuci kortikálního ER. V souhrnu tato práce odkryla další podstatné detaily uspořádání plazmatické membrány kvasinek. Ukázali jsme, že MCC zaujímá specifickou trojrozměrnou strukturu, což pomohlo vysvětlit neobvyklou stabilitu této domény a zároveň vedlo k objasnění struktury eisosomu. Analýza Nce102 pak odhalila způsob, kterým tento protein může přispívat k formování MCC. A v neposlední řadě jsme ukázali, že MCC ovlivňuje rozprostření kortikálního ER pod membránou, což má vliv i na rozmístění dynamických procesů v plazmatické membráně.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Plasma membrane (PM) of living cells hosts variety of important cellular functions that must be precisely coordinated in space and time. Recent research shows that the plasma membrane is organized into specific domains to accomplish all these tasks. Our laboratory is focused on the organization of the plasma membrane in Saccharomyces cerevisiae where several distinct lateral compartments were identified at the fluorescence microscopy level. One of them is the Membrane Compartment occupied by arginine transporter Can1 (MCC) which consists of isolated, highly stable, ergosterol enriched, 300nm patches containing specific proton symporters and proteins of unknown function (Sur7- and Nce102-like). These membrane domains are organized by cytosolic protein complexes called eisosomes, composed mainly of proteins Pil1 and Lsp1. This work is a continuation of studies that tried to elucidate the composition, structure and function of MCC. In the first section of this work we concentrated on ultrastructural characterization of MCC domains. Foremost, we developed a protocol preserving the plasma membrane ultrastructure. The comparison of cryofixed and chemically crosslinked cells clearly showed that cryofixation by high pressure freezing together with freeze substitution and low temperature resin embedding leads to superior sample structure preservation and significantly increased labeling density as compared to conventional aldehyde fixation. We took advantage of these findings in the main part of the thesis that proved that MCC domains correspond to furrow-like plasma membrane invaginations, reported by freeze fracture studies in early sixties. We showed that the plasma membranes of nce102 and pil1 strains, defective in segregation of MCC-specific proteins, lacked the characteristic furrow-like invaginations. Conversely, mutants exhibiting elongated MCC patches in confocal microscope possessed accordingly elongated invaginations under electron microscope. And last but not least, the immunolocalization of Sur7-GFP and Pil1-GFP proteins on ultrathin resin sections confirmed the localization of both markers to furrow-like invaginations. We showed that Nce102p is an important MCC constituent. Therefore, we next focused on the elucidation of its role in MCC formation. Determination of the Nce102p membrane topology suggested that this protein does not span the membrane four times as predicted but that it rather adopts a hairpin conformation which could contribute to furrow formation. We also demonstrated that close and distant Nce102 homologs can substitute this protein in tethering Can1p to MCC and concluded that the function of Nce102-like proteins was conserved in Ascomycota. Our data suggested that the C-terminus is necessary for the Nce102p function. The last part of this work was stimulated by our observations that MCC does not colocalize with the cortical ER network occupying a substantial part of the plasma membrane in yeast. We showed that the deletion of the main MCC organizer, Pil1p, leads to an aberrant redistribution of cortical ER network. As we also found that cortical ER redirects the vesicular transport into distinct, ER-free, plasma membrane areas it is obvious that: 1) cortical ER contributes to a functional compartmentalization of the yeast plasma membrane and 2) MCC is also involved in this functional partitioning of the plasma membrane. In summary, this work has brought new crucial details on the organization of the plasma membrane in budding yeast, with apparent general consequences for other organisms. We ascribed a specific structure to MCC domain which helped to clarify its unusual stability and led to a discovery of eisosome structure. The analysis of Nce102p then suggested how this protein directly affects MCC formation and shaping. And the investigation of cortical ER network showed that its distribution beneath PM is regulated by MCC presence and that this organelle is involved in positioning of various dynamic processes in PM.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Vendula Strádalová, Ph.D. 16.7 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Vendula Strádalová, Ph.D. 165 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Vendula Strádalová, Ph.D. 98 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Zdena Palková, CSc. 117 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Ivo Konopásek, CSc. 98 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 930 kB