velikost textu

Fluorescenční studie bakteriálních membránových proteinů a buněčné signalizace.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Fluorescenční studie bakteriálních membránových proteinů a buněčné signalizace.
Název v angličtině:
Fluorescence studies of bacterial membrane proteins and cell signalling.
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Radovan Fišer, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Ivo Konopásek, CSc.
Oponenti:
doc. Martin Hof, DSc.
doc. RNDr. Jitka Forstová, CSc.
Id práce:
87702
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Mikrobiologie (P1510)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
5. 4. 2011
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
Bordetella, CyaA , translokace proteinu, membránový kanál, planární lipidové membrány, vápníková signalizace, endocytóza, narušování lipozómů, makrofág, Fura­-2
Klíčová slova v angličtině:
Bordetella, CyaA , protein translocation, membrane channels, planar lipid membranes, calcium signalling, endocytosis, liposome disruption, macrophage, Fura­-2
Abstrakt:
Abstrakt (česky)  Tato   práce   shrnuje   pět   publikací,   které   se   zabývají   převážně   adenylátcyklázovým  toxinem   (CyaA)   bakterie  Bordetella   pertussis  a   jeho   interakcí   s   biologickou   membránou.  CyaA   narušuje   buněčné   membrány   tvorbou   malých   kationt­selektivních   kanálů   a   rozvrací  buněčnou signalizaci pomocí enzymu (AC, adenylátcyklázy) přeměňujícího buněčné ATP na  cAMP.  První   studie   objasňuje   mechanizmus   narušování   membrány   v   případě   CyaA   a  příbuzného RTX toxinu,  α­hemolyzinu (HlyA) produkovaného  Escherichia coli. K tomuto  účelu byly použity lipozómy jako umělý membránový systém a fluorescenční zhášecí metoda.  Oba  zkoumané toxiny vykazovaly postupný únik materiálu z lipozómů a rozdílné  iontové  selektivity (Fišer a Konopásek 2009).  Jak doprava AC domény, tak tvorba kanálů jsou závislé na vlastnostech predikovaného  transmembránového  α­helixu   (502­522).   V   naší   práci   jsme   zkoumali   další   predikovaný  transmembránový segment (565­591), který nese kyselé zbytky Glu(570) a Glu(581). Většina  pokusů byla prováděna na erytrocytech a planárních lipidových membránách. Zjistili jsme, že  záporný náboj v pozici 570 je zásadní pro iontovou selektivitu kanálu a je patrně umístěn v  blízkosti jeho ústí. Substituce v obou pozicích zásadně ovlivňují schopnost translokace AC  domény (Basler et al. 2007).  Během bakteriální infekce se toxin CyaA primárně váže na fagocytující buňky nesoucí  na   povrchu  αMβ2  integrin   (CD11b/CD18).   V   další   studii   jsme   popsali   a   zkoumali   novou  aktivitu   CyaA   která   spočívá   ve   zvyšování   intracelulární   koncentrace   vápenatých   iontů  ([Ca2+]i). Toxinem indukovaný nárůst [Ca2+]i  v monocytech J774A.1 nesoucích CD11b nebyl  inhibovatelný specifickými inhibitory buněčných kanálů, ale pouze ionty La3+. To naznačuje,  že vstup Ca2+ do buněk není způsobený buněčnou signalizací. Zdá se, že samotná translokace  AC domény vede k přechodnému vpouštění Ca2+ do buněk (Fišer et al. 2007).  Samotná translokace se patrně odehrává ve dvou krocích; začíná inzercí AC domény  do membrány, kdy dochází k přesunu iontů Ca2+. Tím je spouštěno kalpainem zprostředkované  štěpení   talinu,   který   ukotvuje   integrin   k   cytoskeletu.   Následkem   je   přesun   uvolněného  komplexu   integrin­CyaA   do   lipidových   raftů,   kde   prostředí   bohaté   na   cholesterol   umožní  dokončení translokace AC domény (Bumba et al. 2010).  Schopnost   CyaA   indukovat   vstup  Ca2+  do   cytoplazmy   buněk   určuje   i   posloupnost  dalších dějů, které vedou k aktivnímu uklízení CyaA z povrchu makrofágů. Toxoidy schopné  vpouštění Ca2+ do buněk a přesunu do raftů jsou endocytovány pomocí clathrinových váčků a  procházejí   časnými   endozómy   obsahujícími   marker   transferrin.   Tento   způsob   dopravy  umožňuje následné štěpení toxoidu a prezentaci vzniklých peptidů na molekulách MHC I a II.  Naopak mutantní toxoidy neschopné vpouštění Ca2+ jsou velmi rychle z membrány uklízeny  makropinocytózou nezávislou na clathrinu (Fišer et al. 2011).  Klíčová slova  Bordetella, CyaA , translokace proteinu, membránový kanál, planární lipidové membrány,  vápníková signalizace, endocytóza, narušování lipozómů, makrofág, Fura­2
Abstract v angličtině:
Abstract (English)  This   work   is   based   on   five   publications   studying   mostly   adenylate   cyclase   toxin  (CyaA)   from  Bordetella   pertussis  and   its   interaction   with   biological   membranes.   CyaA  permeabilizes cell membranes by forming small cation­selective pores and subverts cellular  signaling by delivering an adenylate cyclase (AC) enzyme that converts ATP to cAMP into  host cells.  First   study   clarifies   the   membrane   disruption   mechanisms   of   CyaA   and   another  bacterial   RTX   toxin;  α­hemolysin   (HlyA)   from  Escherichia   coli.   For   this   purpose,   we  employed   a   fluorescence   requenching   method   using   liposomes   as   target   membranes.   We  showed that both toxins  induced a graded leakage of liposome content with different  ion  selectivities (Fišer a Konopásek 2009).  Both AC delivery and pore formation were previously shown to involve a predicted  amphipathic  α­helix(502­522). In the second publication we investigated another predicted  transmembrane α­helix(565­591) that comprises a Glu(570) and Glu(581) pair. We examined  the roles of these glutamates in the activity of CyaA, mostly on planar lipid membranes end  erythrocytes.   Negative   charge   at   position   570,   but   not   at   position   581,   was   found   to   be  essential for cation selectivity of the pore, suggesting a role of Glu(570) in ion filtering close  to pore mouth. The pairs of glutamate residues in the predicted transmembrane segments of  CyaA   appear   to   play   a   key   functional   role   in   membrane   translocation   and   pore­forming  activities of CyaA (Basler et al. 2007).  In the next work we describe a new activity of CyaA that yields elevation of cytosolic  calcium concentration ([Ca2+]i) in target cells. The CyaA toxin during the bacterial infection  targets   primarily   phagocytes   expressing   the  αMβ2  integrin   (CD11b/CD18).   The   CyaA­ mediated [Ca2+]i  increase in CD11b+  J774A.1 monocytes was inhibited by extracellular La3+  ions but not by any specific inhibitor of cellular channels, suggesting that influx of Ca2+ into  cells was not because of receptor signaling or opening of conventional calcium channels. The  translocating AC polypeptide  itself  appears  to participate in  formation  of a novel  type   of  unexpected membrane path for calcium ions (Fišer et al. 2007).  We show that penetration of the AC domain across cell membrane proceeds in two  steps.   It   starts   by   membrane   insertion   of   a   toxin   'translocation   intermediate',   that  permeabilizes   cells   for   influx   of   extracellular   Ca2+  and   thus   activates   calpain­mediated  cleavage of the talin tether. Recruitment of the integrin­CyaA complex into lipid rafts follows  and   the   cholesterol­rich   lipid   environment   promotes   full   translocation   of   the   AC   domain  across cell membrane (Bumba et al. 2010).  The ability of CyaA to promote influx of Ca2+ into cells dictates the path and kinetics  of   subsequent   endocytic   removal   of   CyaA   toxoids   from   phagocyte   membrane.   Clathrin­ dependent   endocytosis   and   transit   of   CyaA   through   transferrin­containing   early   recycling  vesicles was observed with the toxoid capable to promote Ca2+  influx and to associate with  membrane   lipid   rafts.   This   uptake   path   allowed   delivery,   processing   and   presentation   of  toxoid­fused antigens on MHC class II molecules. In turn, a mutated toxoid, unable to mediate  Ca2+ influx into cells, was rapidly taken­up from cellular membrane by a clathrin­independent  macropinocytic mechanism (Fišer et al. 2011). Keywords  Bordetella, CyaA , protein translocation, membrane channels, planar lipid membranes,  calcium signalling, endocytosis, liposome disruption, macrophage, Fura­2
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. 1.84 MB
Stáhnout Příloha k práci RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. 14.12 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. 276 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Radovan Fišer, Ph.D. 273 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Martin Hof, DSc. 110 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jitka Forstová, CSc. 312 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 752 kB