velikost textu

Spatiotemporal regulation of Lck activity in the initiation of TCR signalling

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Spatiotemporal regulation of Lck activity in the initiation of TCR signalling
Název v češtině:
Časoprostorová regulace aktivity kinázy Lck při zahájení TCR signalizace
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Ondřej Ballek
Školitel:
RNDr. Dominik Filipp, CSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D.
Ing. Tomáš Vomastek, Ph.D.
Id práce:
85257
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Imunologie (P1517)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
22. 6. 2017
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Dizertační práce: Časoprostorová regulace aktivity kinázy Lck při zahájení TCR signalizace Ondřej Ballek Abstrakt T-lymfocyty jsou bezpochyby nejvíce studovanými buňkami imunitního systému. Jsou klíčovými hráči specifické imunity zodpovědnými za cílenou odpověď proti patogenům a jiným signálům nebezpečí. Díky jejich centrálnímu významu vede často jakákoliv porucha regulace jejich aktivity k imunopatologiím. Znalost jejich bio destruktivní efektorové funkce je tedy velice zásadní. Dodnes panují rozpory, jakým molekulárním mechanismem probíhá zahájení T-buněčné aktivace. Po rozeznání specifického antigenu prostřednictvím antigen-prezentující buňky a T-buněčného receptoru je aktivační signál přenesen přes plasmatickou membránu, kde následuje fosforylace cytoplasmatických částí T-receptorového komplexu. Tato událost je obecně považována za první biochemický znak aktivace T-lymfocytů v procesu zvaném „TCR triggering“. Jak se však aktivační signál dostane do buňky a jaké mechanismy regulují samotné zahájení signalizace, jsou dvě základní, avšak dosud nezodpovězené, otázky. V této práci jsme se zaměřili především na mechanismy regulace T-buněčné aktivace a tři související problémy. V prvním jsme se zabývali časoprostorovou organizací důležitých signálních molekul před a po aktivaci T-lymfocytů v kontextu tzv. lipidových mikrodomén, u kterých předpokládáme, že hrají důležitou úlohu v organizaci membrány během jejich aktivace. Zkoumali jsme především kinázu Lck, která je považována za hlavní generátor signálu zahajujícího T-buněčnou signalizaci. Pomocí biochemických metod jsme studovali distribuci aktivní formy kinázy Lck (pY394Lck) v membráně. Nejenže jsme ukázali, že v naivních T-lymfocytech je pY394Lck v omezeném množství přítomna téměř výlučně ve vysokomolekulárních komplexech, ale také jsme zjistili, že po aktivaci T-lymfocytů dojde ke značnému nárůstu množství této aktivované formy Lck a zároveň jejímu přesunu do lipidových mikrodomén. Podstatné rozdíly v kvantifikaci pY394Lck v naší a v předchozích studiích, které naopak poukazují na velké množství již aktivní Lck v nestimulovaných T-buňkách jež se po aktivaci nemění, vedou k odlišným závěrům ohledně úlohy pY394Lck. Vzhledem k tomu, že právě pY394Lck iniciuje samotné zahájení signalizace, je otázka bazální Lck aktivity velice důležitá. Dále jsme se proto zabývali tím, co způsobuje takovéto rozpory. Prokázali jsme, že většina těchto nesrovnalostí pramení z nekonsistence postupů při přípravě vzorků a vysoká úroveň detekované pY394Lck je tedy důsledek nekontrolované spontánní aktivace kinázy Lck během buněčné lýze. Již dříve jsme ukázali, že aktivací T-lymfocytů způsobený přesun kinázy Lck v rámci plasmatické membrány je důležitý pro její samotnou funkci, avšak mechanismus tohoto procesu není znám. V další části našeho výzkumu jsme se proto zaměřili na objasnění tohoto redistribuční procesu kinázy Lck a poprvé jsme identifikovali formování dočasného Lck-RACK1-cytoskeleton komplexu. Účast cytoskeletu v organizaci signálních molekul v rámci T-buněčné aktivace tak přináší další úroveň komplexity regulace T-receptorové signalizace. Závěrem, tato práce přináší řadu nových poznatků týkajících se příspěvku membránové organizace k časoprostorové regulaci aktivity kinázy Lck, stejně jako k dalším signálním komponentám účastnících se zahájení T-buněčné signalizace.
Abstract v angličtině:
Ph.D. Thesis: Spatiotemporal regulation of Lck aktivity in the TCR signalling Ondřej Ballek Abstract Arguably, the most studied cell types of immune system are T-cells. They are key players of adaptive immunity responsible for targeted action against pathogens or other danger signals. Due to their central importance, any alteration in the regulation of their activity leads often to immunopathology. Thus, the knowledge how to harness their bio-destructive effector functions is of critical importance. Up today, there is only limited consensus on the nature of molecular mechanisms controlling the initiation of T-cell activation. When T-cell receptor (TCR) recognizes its cognate antigen presented on antigen presenting cell (APC), the activation signal is transmitted through the plasma membrane and subsequent phosphorylation of cytoplasmic chains of TCR complex ensues. This is commonly considered as the first biochemical sign of T-cell activation, the process called TCR triggering. How the activation signal gets into the cell and which molecular mechanisms control TCR triggering are two fundamental, yet still unanswered questions. In this study we focused mainly on the latter one. Working within this experimental framework, we investigated three particular problems. The first one concerns the spatiotemporal organization of critical signalling molecules before and after TCR engagement in the context of lipid microdomains that, as we posited, act as an important membrane organizational principal in the regulation of TCR triggering. We mainly focused on Lck kinase which is considered as the main signal-generating element initiating TCR signalling. Using a biochemical approach, we determined membrane distribution of the active form of Lck (pY394Lck), the key factor in TCR triggering. In this context we not only showed that in naïve T-cells a limited pool of pY394Lck almost exclusively partition into high molecular weight complexes, but also that after TCR engagement, this pool is significantly increased together with its redistribution to lipid microdomains. Unfortunately, quantitative discrepancies between these and previously reported studies, where pY394Lck levels were found significantly higher and invariant after TCR activation, lead to different conclusions about the role and steady-state levels of active Lck in T-cells. Because pY394Lck drives TCR triggering, the question of the basal level of pY394Lck in naïve T-cell is of central interest. To reconcile these results, in the second line of our research, we provided evidence that most of these discrepancies stemmed from inconsistencies within technical procedures used for sample preparations and that highly saturated levels of pY394Lck were results of uncontrollable spontaneous activation of Lck during cell lysis. Lastly, we previously demonstrated that activation- induced Lck redistribution within plasma membrane was critical for delivery of its function, yet, the mechanism has been unknown. Thus, in the third line of research, we identified, for the very first time, the transient formation of Lck-RACK1-cytoskeleton complexes able to affect Lck redistribution process. The involvement of cytoskeleton in the spatiotemporal organization of signalling molecules provides yet another level of complexity in the regulation of TCR signalling. Taken together, this study provides strong evidence for the contribution of membrane organization to spatiotemporal regulation of Lck activity as well as other signalling components involved in the initiation of TCR signalling.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Ondřej Ballek 21.65 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Ondřej Ballek 138 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Ondřej Ballek 134 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D. 519 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Tomáš Vomastek, Ph.D. 245 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 510 kB