velikost textu

Genome reprogramming during the first cell cycle of embryonic development

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Genome reprogramming during the first cell cycle of embryonic development
Název v češtině:
Remodelace genomu během prvního buněčného dělení embryogeneze
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Irena Barnetová, Ph.D.
Školitel:
Ing. Josef Fulka, DrSc.
Oponenti:
RNDr. doc. Jana Pěknicová, CSc.
Doc., RNDr. František Strejček, Ph.D.
Id práce:
85254
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Vývojová a buněčná biologie (P1529)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
22. 9. 2011
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
embryo, epigenetika, iICSI, prase, myš
Klíčová slova v angličtině:
embryo, epigenetics, iICSI, pig, mouse
Abstrakt:
ABSTRAKT Spermie obsahuje vysoce kompaktní genom. Tato kompaktnost je zprostředkována protaminy. Během oplození jsou protaminy spermie nahrazeny histony z cytoplazmy oocytu. Vedle výměny proteinů nastává i epigenetická remodelace. Mezi nejvíce studované epigenetické remodelace patří aktivní demetylace paternálního prvojádra. Tento jev byl pozorován u některých savců (myš, krysa, opice). Naopak u jiných druhů savců (ovce) aktivní demetylace prokázána nebyla. U některých druhů byly dokonce pozorovány obě varianty (prase, člověk, koza, králík). Práce se zaměřuje na modelový druh prasete a pokouší se objasnit důvody rozporuplných výsledků aktivní demetylace paternálního prvojádra pozorovaných u prasete. V této práci byly prověřeny tři možné faktory - technika produkce embryí, faktory spermie a kvalita oocytů. V první části práce byly porovnány zygoty vytvořené pomocí IVF (klasické in vitro oplození) a ICSI (intracytoplazmatická injekce spermie). Epigenetická remodelace prvojader byla analyzována pomocí nepřímé imunofluorescence. Mezi zygotami nebyl pozorován žádný signifikantní rozdíl. Paternální genom nepodléhal aktivní demetylaci ani v jednom typu embryí. Značení pomocí anti-H3/K9-me2 (dimetylace na lysinu 9 histonu 3) ukázalo pozitivní signál v obou prvojádrech přibližně v polovině případů. Druhá část práce se zaměřuje na faktory spermie. Za tímto účelem byla použita metoda iICSI (mezidruhová intracytoplazmatická injekce spermie), která umožňuje experimentálně oddělit maternální a paternální podíl v zygotě. Myší oocyty byly injikovány kančími a lidskými spermiemi, dále oocyty prasete byly injikovány spermiemi myší. Ve všech zmíněných kombinacích došlo k vytvoření paternálního prvojádra. Paternální genom prasete a člověka byl v oocytu myši aktivně demetylován. Naproti tomu v oocytu prasete nedošlo k demetylaci paternálního genomu myši. Z výsledků vyplývá, že remodelace paternálního genomu je ovlivněna především cytoplazmou oocytu. Navíc spermie prasete, které nepodléhají demethylaci v prasečím oocytu, podléhají aktivní demetylaci v oocytu myši. Třetí část práce se zaměřuje na kvalitu oocytů. Za tímto účelem byla srovnávána embrya odvozená z ovulovaných a in vitro maturovaných oocytů myši a prasete (metoda ICSI a iICSI). Rozdílná kvalita oocytů byla patrná u obou druhů, a to především v aktivační schopnosti oocytu. V případě myši in vitro maturované oocyty nebyly schopny vytvořit paternální prvojádro kančího původu. Ovulované oocyty toto prvojádro vytvářely bez problémů. Podobně in vitro maturované oocyty prasete vytvářely paternální prvojádro myšího původu pouze po dodatečné aktivaci oocytu elektrickým pulzem, zatímco ovulované oocyty prasete paternální prvojádro myšího původu vytvořily i bez dodatečné aktivace. V oblasti epigenetické remodelace byl patrný pouze malý rozdíl. Vnitrodruhové zygoty myši odvozené z in vitro maturovaných oocytů se lišily od zygot z ovulovaných oocytů pouze v míře DNA demetylace 12 hpf (hodin po oplození). V případě oocytů prasete nebyl pozorován žádný rozdíl v epigenetické remodelaci mezi zygotami. Navíc aktivní demetylace paternálního prvojádra nebyla pozorována v žádném typu embryí prasete, a to ani ve vnitrodruhových zygotách vytvořených intracytoplazmatickou injekcí spermie do ovulovaného oocytu. Z našich výsledků vyplývá, že technika, faktory spermie a ani kvalita oocytu zásadně neovlivňují výslednou epigenetickou remodelaci zygoty. Předpokládáme, že důvod rozporuplných výsledků pozorovaných u prasete má mnohem komplexnější charakter. Zdá se, že příčina není v kvalitě oocytu, jak je často prezentováno, ale v dalších, dosud neznámých, faktorech.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT The sperm head contains highly compacted genome. This compaction is mediated by protamines. Sperm protamines are replaced by cytoplasmic histones after the sperm entry into the oocyte. Beside the proteins replacement, also some epigenetic remodeling occurs. One of the most studied epigenetic remodeling in early zygotes is DNA demethylation. This phenomenon was observed in some mammals (mouse, rat, monkey) but not in some other mammals (sheep) and what is more, in some of them quite inconsistent data were published (pig, human, goat, rabbit). In our work we were mostly concentrated on porcine zygotes and attempted to explain the reasons of inconsistency in observed data. Three factors were evaluated in our work – the technique of embryo production, sperm factors, and the oocyte quality. In the first part of the study (the technique of embryo production) we compared the zygotes produced by conventional in vitro fertilization and zygotes produced by intracytoplasmic sperm injection. The epigenetic remodeling was evaluated by immunolabeling. There were no differences between zygotes produced by the two mentioned techniques. The paternal genome was not demethylated in any of zygotes. The labeling with anti-H3/K9- me2 (anti dimethyl group on lysine 9 of histone 3) showed the positive labeling of both pronuclei in about half of zygotes. In the second part of the study (sperm factors) we aimed at sperm factors. The technique of interspecific intracytoplasmic sperm injection (iICSI) was used to experimentally separate the oocyte and sperm factors. We injected boar spermatozoa into mouse oocytes, human spermatozoa into mouse oocytes, and mouse sperm heads into porcine oocytes. All the injected spermatozoa (or sperm heads) formed the paternal pronucleus in oocytes of different species. The paternal genome of porcine and human origin was demethylated in mouse oocytes. In contrast, the paternal genome of mouse origin was not demethylated in porcine oocytes. From these results it is clear that oocytes cytoplasm mainly affects the paternal genome remodeling. Moreover, boar spermatozoa, which are not demethylated in porcine zygotes, are able to undergo the active demethylation in cytoplasm of other specie. In the third part of the study (the oocyte quality) we compared mouse and porcine ovulated and in vitro matured oocytes. The oocytes were used for embryo production by intracytoplasmic sperm injection techniques (ICSI and iICSI). We observed a difference between ovulated and in vitro matured oocytes in both species. The difference was more evident in activation capabilities of oocytes then in epigenetic remodeling capabilities. The mouse ovulated oocytes are able to form the paternal pronucleus of porcine origin. In contrast, the mouse in vitro matured oocytes were not able to form the paternal pronucleus of porcine origin. Similarly, the paternal pronucleus of mouse origin was formed in porcine ovulated oocytes, but the in vitro matured oocytes formed the paternal pronucleus only after additional activation with the electrical pulse. Only a small difference was observed in epigenetic remodeling in mouse control zygotes (intraspecies) produced from ovulated and in vitro matured oocytes (extent of DNA demethylation). In addition, no difference was observed in porcine control zygotes (intraspecies) produced from ovulated and in vitro matured oocytes. Moreover, we did not observe the DNA demethylation of paternal pronucleus in porcine zygotes which is agreement with some reported studies but in contrast with some other studies. From these results we concluded that the technique used for embryo production, sperm factors, or the quality of oocytes did not affect the final epigenetic remodeling in zygotes. We suppose that the problem of inconsistent data observed in pig is much more complicated. It seems that the reason is not mainly in the quality of oocyte, as is often quoted, but in some other not defined factors.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Irena Barnetová, Ph.D. 429 kB
Stáhnout Příloha k práci RNDr. Irena Barnetová, Ph.D. 5.17 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Irena Barnetová, Ph.D. 63 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Irena Barnetová, Ph.D. 61 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce RNDr. Irena Barnetová, Ph.D. 399 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. doc. Jana Pěknicová, CSc. 237 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc., RNDr. František Strejček, Ph.D. 96 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 783 kB