velikost textu

Neurogeneze a gliogeneze po ischemickém poškození mozku u EGFP/GFAP myší

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Neurogeneze a gliogeneze po ischemickém poškození mozku u EGFP/GFAP myší
Název v angličtině:
Neurogenesis and gliogenesis after ischemic brain injury in EGFP/GFAP mice
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Mgr. Veronika Dlouhá
Vedoucí:
Ing. Miroslava Anděrová, CSc.
Oponent:
doc. MUDr. Lýdia Vargová, Ph.D.
Id práce:
85138
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Buněčná a vývojová biologie (NBUNVYB)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
15. 9. 2011
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Fokální ischemické poškození mozku zvyšuje neurogenezi/gliogenezi v subventrikulární zóně (SVZ) postranních komor a také vede k tvorbě gliální jizvy v blízkosti ischemické léze. Na tvorbě gliální jizvy se podílejí zejména reaktivní astrocyty exprimující gliální fibrilární acidický protein (GFAP), který je exprimován i v dospělých multipotentních neurálních kmenových buňkách (NSCs). Z tohoto důvodu jsme použili GFAP/EGFP transgenní myši, ve kterých je zelený fluorescenční protein (EGFP) exprimován pod kontrolou lidského promotoru GFAP, jak v astrocytech, tak v NSCs což nám umožnilo jejich okamžitou vizualizaci a sledování vlivu ischemického poškození na jejich diferenciační a proliferační potenciál in vitro. Fokální ischemické poškození bylo navozeno okluzí střední mozkové artérie (MCAO) a po třech dnech byla provedena imunohistochemická analýza mozku. Navíc byla provedena izolace buněk ze SVZ a z oblasti gliální jizvy, následovaná jejich kultivací v proliferativních podmínkách ve formě neurosfér, a jejich následnou diferenciací po dobu 7-10 dnů. Diferenciační potenciál těchto buněk byl studován imunocytochemickými analýzami a metodou terčíkového zámku byl sledován vliv na jejich membránové vlastnosti. Na základě zvýšené proliferace a změně exprese specifických neurálních/gliálních markerů, jsme potvrdili, že po mozkové ischemii je zvýšena míra neurogeneze v SVZ postranních mozkových komor a gliogeneze v gliální jizvě vznikající v mozkové kůře. Dále jsme ukázali, že je v neurosférách významně zvýšena proliferace NSCs a progenitorových buněk (PCs) izolovaných ze SVZ ischemických zvířat. Průměrná velikost těchto neurosfér z myší po “sham” operaci (kontrola) byla 176,8 µm, zatímco z ischemických zvířat dosáhly signifikantně větší velikosti (222,1 µm). Navíc počet EGFP pozitivních (EGFP+) neurosfér byl také signifikantně větší; 17,9 % EGFP+ neurosfér bylo nalezeno u kontroly, zatímco po MCAO jich bylo napočítáno 32,5 %. To znamená zvýšení počtu proliferujících NSCs po ischemii. N druhou stranu z oblasti gliální jizvy jsme získali jen velmi malý počet neurosfér, žádná z nich neexprimovala EGFP, ale exprimovaly NG2 proteoglykan. To naznačuje, že reaktivní astrocyty přítomné v gliální jizvě, nemají vlastnosti neurálních gliových buněk, ačkoliv exprimují specifické markery jako je vimentin, RC2 nebo nestin. Dále jsme po disociaci neurosfér a vysetí buněk na poly-L-lysinem potažená skla, studovali membránové vlastnosti diferencovaných buněk pomocí imunocytochemie a metody terčíkového zámku v konfiguraci „whole-cell“. Buněčná kultura ze SVZ po ischemii obsahovala vyšší počet NSCs/astrocytů (64.2 %) a nižší počet neurálních prekurzorů (20,9 %), ve srovnání s kulturou ze SVZ kontrolních myší (42.7 % NSCs/astrocytů a 40.9 % neurálních prekurzorů). Navíc v odpovědi na ischemii byla v NSCs/astrocytech signifikantně zvýšena proudová hustota dovnitř usměrněných K+ kanálů z 0.4 pA/pF u kontroly, na 2 pA/pF, zatímco v PCs a neurálních prekurzorech byla signifikantně snížena proudová hustota rychle se aktivujících/inaktivujících vně usměrněných K+ (KA) kanálů. V kontrole byla KA průměrná proudová hustota v PCs 26.2 pA/pF, zatímco v kultuře z ischemické SVZ byla 3.8 pA/pF. Podobně neurální prekurzory měly v kontrole KA proudovou hustotu 88.1 pA/pF, a po ischemii pouze 9.4 pA/pF. Ve shrnutí lze tedy říci, že ischemické poškození ovlivňuje proliferační potenciál NSCs/PCs, a zároveň má vliv i na diferenciační potenciál buněk ze SVZ, jmenovitě na jejich membránové vlastnosti.
Abstract v angličtině:
Focal ischemia induces enhancement of neurogenesis/gliogenesis in the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and it also leads to glial scar formation in the vicinity of the ischemic lesion. The gliotic scar is mainly formed by reactive astrocytes that express glial fibrilarly acidic protein (GFAP), nevertheless this protein is also expressed in adult multipotent neural stem cells (NSCs). Therefore, we have used the strain of transgenic mice (GFAP/EGFP mice), in which the enhanced green fluorescent protein (EGFP) is expressed under human GFAP promoter in astrocytes as well as in NSCs, thus allowing us an immediate vizualization of these cells, and to estimate the effect of ischemic injury on their fate during proliferation and differentiation in vitro. Focal ischemia was induced by the occlusion of the middle cerebral artery (MCAO) and 3 days post injury, an immunohistochemical analysis was carried out. Furthermore, the cell isolation from SVZ and the region of gliotic scar was performed, followed by their cultivation under proliferative conditions (as neurospheres) and their differentiation for 7-10 days. The differentiation potential of these cells was studied using immunocytochemical analyses and patch clamp technique was employed to estimate their membrane properties. Based on increased proliferation and changes in the expression of specific neuronal/glial markers we have confirmed that a marked enhancement in SVZ neurogenesis and an increase in gliogenesis in the region of cortical lession occur in response to MCAO. Furthermore, we have showed that in neurospheres, the proliferation of NSCs and progenitor cells (PCs) isolated from SVZ of ischemic animals is markedly increased. The average diameter of neurosphers obtained from sham-operated (control) mice was 176.8 µm, while in those obtained from SVZ of ischemic mice was significantly higher (222,1 µm). Moreover, the number of EGFP-positive (EGFP+) neurospheres also significantly increased; 17.9% of EGFP+ neurospheres were found in controls, while 32.5 % neurospheres was EGFP positive in those obtained after MCAO. This suggests an increase in the number of proliferative NSCs in response to ischemia. On the other hand, the number of neurospheres that were obtained from the region of gliotic scar was very low, none of the neurospheres expressed EGFP and they expressed NG2 proteoglycan. This suggests that reactive astrocytes in gliotic scar do not have the properties of NSCs, despite the fact that they express their specific markers, such as vimentin, RC2 or nestin. Furthermore, after neurosphere dissociation and cell platting onto poly-lysine coated coverslips we have studied the membrane properties of differentiated cells using immunocytochemistry and the patch-clamp method in the whole-cell configuration. The cell culture obtained from SVZ after ischemia contained higher number of NSCs/ astrocytes (64.2 %) and lower number of neural precursors (20.9 %), when compared to that obtained from SVZ of control mice (42.7 % NSCs/astrocytes and 40.9 % neural precursors). Additionally, in response to ischemia the current densities of inwardly rectifying K+ channels were significantly increased in NSCs/astrocytes, from 0.4 pA/pF in controls to 2 pA/pF, while in PCs and the neural precursors the current densities of fast activating/inactivating outwardly rectifying K+ (KA) channels were significantly lowered. In controls the average KA current density of PCs was 26.2 pA/pF , while in the culture obtained from ischemic SVZ the KA current density was 3.8 pA/pF. Similarly , neural precursors of controls had the KA current density of 88.1 pA/pF and after ischemia only 9.4 pA/pF. In summary, the ischemic injury affects proliferative potential of NSCs/PCs, however it affects also the differentiation potential of cells isolated from SVZ, namely their membrane properties.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Veronika Dlouhá 3.35 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Veronika Dlouhá 59 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Veronika Dlouhá 59 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Ing. Miroslava Anděrová, CSc. 462 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Lýdia Vargová, Ph.D. 143 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 57 kB