velikost textu

Nitrile hydrolysing enzymes: Fungal nitrilases

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Nitrile hydrolysing enzymes: Fungal nitrilases
Název v češtině:
Enzymy hydrolyzující nitrily: fungální nitrilasy
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Vojtěch Vejvoda
Školitel:
Ing. Ludmila Martínková, CSc.
Oponenti:
prof. Ing. Zdeněk Wimmer
Ing. Simona Vosáhlová, CSc.
Id práce:
85124
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
18. 6. 2010
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Biochemistry A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy Nitrile-hydrolysing enzymes: Fungal nitrilases Mgr. Vojtěch Vejvoda Supervisor: Ing. Ludmila Martínková, CSc. Laboratory of Biotransformation, Institute of Microbiology, v.v.i. Academy of Sciences of the Czech Republic Consultant: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DrSc. Faculty of Science, Department of Biochemistry, , Charles University in Prague Prague 2010 ÚVOD Nitrily jsou v přírodě všudypřítomné, nejen jako přírodní látky tvořené rostlinami, ale i jako sekundární metabolity mikroorganismů a vyšších organismů. Umělé nitrily a anorganické kyanidy se vyskytují v prostředí jako znečištění způsobené člověkem (průmyslové odpady, herbicidy, atd.). Přírodní i umělé nitrily jsou pro mnohé organismy jedovaté. Přírodní nitrily slouží jako obrana proti nepřátelům (např. pro rostliny to jsou býložravci), umělé nitrily jako herbicidy. Jakkoliv tyto sloučeniny negativně ovlivňují živé organismy ve svém okolí, tvoří také evoluční tlak, který pravděpodobně vede k tvorbě enzymů katalyzujících jejich odbourávání, a co více, i k jejich využití jako zdroje energie. Enzymy hydrolyzující nitrily jsou mezi organismy poměrně vzácné. Vyskytují se v určitých čeledích prokaryot (nitrilasy, nitrilhydratasy) a eukaryot (nitrilasy). V této práci bylo zkoumáno několik mikrobiálních enzymů katalyzujících přeměnu nitrilů (viz Obr. 1) s cílem použít je např. pro zlepšení organických syntéz nebo pro detoxifikaci odpadů. R aldoxime dehydratase R R nitrilase HO HO N CH C R N C C R C C R + NH3 + 2H2O H - H2O H O H aldoxime nitrile carboxylic acid nitrile + H2O +HO 2 P450 hydratase amidase H2N R H2N R C C R CH C R O H HOOC H amide of carboxylic acid amino acid Obrázek 1 Reakční schéma enzymů zapojených do metabolismu nitrilových sloučenin R – H nebo alkyl Je mnohem více známo o bakteriálních nitrilasách než o těchto enzymech ve vyšších organismech, jako jsou vláknité houby. Proto jsme si vybrali posledně jmenované, abychom rozšířili znalosti o těchto enzymech a abychom našli nové slibné biokatalyzátory. Své úsilí jsme zaměřili na houby Fusarium solani O1 a IMI 196840 (Vejvoda et al., 2008; Vejvoda et al. 2010), kde jsme se věnovali jejich schopnosti produkovat nitrilasy a popisu strukturních a katalytických vlastností nitrilas. Nedílnou součástí práce bylo ověření technik, které by mohly být vhodné pro imobilizaci těchto nepříliš stabilních enzymů. Další část výzkumu byla zaměřena na odhalení nových vlastností enzymatického systému nitrilhydratasa/amidasa. Pro tuto část výzkumu byl používán bakteriální kmen Rhodococcus rhodochrous A4. Amidasa produkovaná tímto kmenem byla charakterizována a byl vyzkoušen její syntetický potenciál (acyl-transferasová aktivita). Nitrilasa a amidasa byly použity společně v kaskádovém systému s úmyslem zvýšit čistotu produktu (karboxylové kyseliny) odstraněním vedlejšího produktu (amidu). NITRILASY Problém s dostatečnou indukcí nitrilasové aktivity byl vyřešen Ing. Kaplanem (Kaplan et al., 2006) a na základě této práce byl vybrán 2-kyanopyridin jako velmi užitečný induktor pro všechny testované druhy vláknitých hub (zvyšoval aktivitu až o tři řády). Další koncepcí pro zvýšení aktivity byla dvoukroková kultivace, která se ukázala přínosnou pro oba zkoumané druhy rodu Fusarium. Další výhodou rodu Fusarium byla stabilita lyofilizovaného mycelia, kde nebyla pozorována žádná ztráta aktivity po dobu jednoho roku (pro mycelium skladované při -20 °C). Výsledky indukce aktivity u kmenů rodu Fusarium jsou shrnuty v tabulce 1. Tabulka 1 Různé kultivační metody hub F. solani pro produkci nitrilasy Fusarium solani O1 Fusarium solani IMI 196840 Celková aktivita Celková aktivita Zvýšení Zvýšení (U.l-1) (U.l-1) původní induktor původní induktor 3,2 4 (3-kyanopyridin) (benzonitril) 2-kyanopyridin jako induktor jendokroková 437 137 kultivace dvoukroková dvoukroková 3000 938 1565 391 kultivace kultivace Purifikace a strukturní vlastnosti Většina nitrilas, včetně všech známých enzymů z hub, jsou vysokomolekulární proteiny (obvykle větší než 400 kDa (O'Reilly and Turner, 2003)) a tudíž se jako nejvhodnější purifikační metoda jeví gelová filtrace. Nicméně velký počáteční objem extraktu byl nevhodný pro použití na této koloně. Tento fakt nás vedl k použití Phenyl Sepharosové (low sub) kolony jako prvního kroku, což vedlo k zahuštění enzymového roztoku (následováno zahuštěním pomocí centrifugačních membránových filtrů). Gelová filtrace na Sephacrylu S- 200 byla použita jako druhý krok a konečným krokem byla iontoměničová chromatografie na Q Sepharose, která produkovala dva lehce oddělitelné píky, přičemž jeden z nich poskytoval nitrilasu ve vysoké čistotě, což se potvrdilo pomocí SDS-PAGE a cirkulárního dichroismu (Vejvoda et al., 2008; Vejvoda et al. 2010). Purifikace je krátce shrnuta v tabulce 2. Tabulka 2 Shrnutí purifikace nitrilas z kmene Fusarium Specifická aktivita pro Purifikace Výtěžek Organismus benzonitril (násobek) (%) (U mg-1) F. solani O1 9,9 25,7 156 F. solani IMI 196840 20,3 26,8 144 Obě nitrilasy byly purifikovány s výtěžkem přibližně 25 % původní aktivity a specifická aktivita pro benzonitril (referenční substrát) byla přibližně 150 U.mg-1proteinů. Tato aktivita je srovnatelná s aktivitou bakteriálních nitrilas, a ani mezi enzymy z hub není výjimečná. To ukazuje na potenciální využití těchto enzymů v laboratorní a průmyslové praxi. Molekulová hmotnost enzymové podjednotky, stanovená SDS-PAGE, byla přibližně 40 kDa pro obě nitrilasy. SDS-PAGE elektroforéza při redukčních a normálních podmínkách nevedla ke změně migrace nitrilas, takže se v molekule enzymu pravděpodobně nevyskytují disulfidové můstky. Pomocí cirkulárního dichroismu ve vzdálené UV oblasti (CD) bylo zjištěno poměrné zastoupení sekundárních struktur v molekule enzymu a enzymy mohly být spolu porovnány. Toto měření bylo provedeno jako součást stáže v Loschmidtových laboratořích (Masarykova Universita, Brno) pod dohledem prof. J. Damborského a Dr. R. Chaloupkové. Data pro obě nitrialasy z Fusaria a pro rekombinantní nitrilasu z Aspergillus niger K10 získaná technikou CD jsou v tabulce 3. Tabulka 3 Sekundární struktury v molekule nitrilas α-Helix β-struktura Ohyb Jiné Tm Organismus (%) (%) (%) (%) (°C) F. solani O1 30 20,8 16,4 32,8 47,8 F. solani IMI 196840 30 21 16,4 32,6 49,3 A. niger K10 - rekombinantní 26,4 23,5 17,4 32,7 45-50 Tm – teplota tání (polovina enzymu je nativní, druhá polovina již denaturovaná) Katalytické vlastnosti Podobně jako v případě struktury jsou si obě nitrilasy druhu Fusarium velmi podobné i katalytickými vlastnostmi, vyjma drobných odchylek v substrátové specifitě. Nejvyšší aktivita byla pro oba enzymy zaznamenána v teplotním rozmezí 40 – 50 °C a při slabě bazickém pH 8. Purifikovaný enzym z F. solani O1 vykazoval specifickou aktivitu 156 U.mg- 1proteinů a enzym z F. solani IMI 196840 specifickou aktivity 144 U.mg-1proteinů pro benzonitril, což je srovnatelná aktivita jako pro dříve purifikovanou nitrilasu kmene F. oxysporum f.sp. melonis (Goldlust a Bohak, 1989). Purifikované nitrilasy můžeme klasifikovat podle jejich substrátové specifity jako aromatické, ale jsou schopny akceptovat i alifatické nitrily, ovšem s podstatně nižší aktivitou. Aromatické nitrily se substituentem v poloze 2 jsou obecně špatnými substráty, pravděpodobně ze sterických důvodů. 4-Kyanopyridin, a ze substituované aromátů 3- chlorbenzonitril jsou pro oba enzymy nejlepšími substráty. Imobilizace Pro zlepšení stability, např. pro dlouhodobé reakce, se často používá imobilizace, protože mnohé z těchto metod snižují efekty nepříznivých faktorů (tvorbou mikroprostředí), fixují strukturu enzymu a zmírňují denaturaci proteinového skeletu. Imobilizace samozřejmě také zabraňuje unikání enzymu z reakce. U nitrilas jsme zjistili, že mírné imobilizační techniky (fyzikální sorpce) vedou jen k malým ztrátám aktivity, ale bylo pozorováno vyplavování enzymu. Silné interakce (kovalentní) vedly při imobilizycích k značným ztrátám aktivity. Také jsme zkoušeli, je-li vhodné používat nitrilasy v trvale míchaných reaktorech (CSMR). Trvalý přísun čerstvého substrátu a odplavování produktu posouvá rovnováhu ve prospěch produktů. Pokles aktivity může být jednoduše doplněn novým přídavkem enzymu (Malandra et al., 2009). Pro odstranění vedlejšího produktu hydrolýzy nitrilů (amidu) byla použita amidasa (viz obrázek 1 a 2). Byly zkoušeny dvě možnosti: imobilizace amidasy a nitrilasy společně, a oddělená imobilizace (každý enzym na jedné kolonce, kolonky spojené za sebou). Obě metody snižovaly množství amidu, ale v případě 4-kyanopyridinu zapojení odděleně imobilizovaných enzymů za sebou vedlo k mnohem efektivnějšímu odstranění amidu (ve výsledném produktu méně než 0,2 % amidu) a vedlo k produkci velmi čisté kyseliny. Obrázek 2 Bienzymatické reakce NITRILHYDRATASOVÝ/AMIDASOVÝ SYSTÉM Alternativní enzymový nástroj pro biotransformace nitrilů je prokaryotický systém nitrilhydratasy/amidasy, kde je možnost kontroly produkce amidu oproti karboxylové kyselině změnou reakčních podmínek nebo času. Nevýhodou je nižší stability nitrilhydratasy. Fyzikálně-chemické vlastnosti amidasy a nitrilhydratasy se zdají být velmi podobné, proto bylo velmi obtížné je separovat např. na kolonách Q nebo Butyl Sepharose. Hlavním přínosem těchto purifikačních kolon bylo odstranění balastních proteinů. Separace výše zmíněných enzymů probíhala pouze na koloně Superdex, která má vynikající parametry ve srovnání s jinými kolonami pro gelovou chromatografii, ale nevýhodou je relativně malý objem nanášeného vzorku (500 μl). Nejlepšími substráty pro amidasu byly benzamid a nikotinamid. Purifikace proběhla s uspokojivým výtěžkem 16 %, ale specifická aktivita se zvýšila jen 5krát. To naznačuje, že enzym nebyl purifikován úplně, což bylo potvrzeno pomocí SDS-PAGE. Acyl-transferasové reakce Již dříve bylo zjištěno, že amidasy jsou schopny přenášet acyl na jiné akceptory než vodu. Takovými akceptory mohou být aminy, ale také hydroxylamin nebo hydrazin (Fournand et al., 1998). Reakce zahrnující posledně dva jmenované vedou k tvorbě užitečnýh hydroxamátů a hydrazidů. Hydroxamáty jsou chelatační činidla použitelná jako antibiotika (vorinostat), růstové nebo tumorové inhibitory. Acyl-transferásová aktivita amidasy z R. erythropolis A4 byla zkoušena s pozitivním výsledkem. Amidy (substráty) byly připravovány in situ z nitrilů za použití nitrilhydratasy ze stejného organismu nebo heterologně exprimované nitrilhydratasy (ve spolupráci s University of Hohenheim, Institute of Food Science and Biotechnology, kde byly tyto enzymy připraveny). V prvním kroku – konverze nitrilu na amid – byla využívána nitrilhydratasová aktivita hrubého extraktu, kde bylo třeba potlačit amidasovou aktivitu (přeměnu amidu na karboxylovou kyselinu). Proto bylo třeba nalézt selektivní inhibitor amidasy. Jako velmi vhodný se ukázal amonný ion. Reversibilita inhibice byla další výhodou, jelikož po snížení koncentrace amonných iontů mohla být amidasa použita pro transfer acylu na hydroxylamin (viz obrázek 3). CN CONH2 COOH CONH2 COOH nitrile hydratase amidase + H2O - NH4+, + H2O < NH4+ addition selective (reversible ) + + amidase inhibition NH4 NH4 CN CONH2 COOH CONH2 COOH nitrile hydratase + H2O + X X amidase - NH4+, + H2O >> NH4 + NH+ NH4 4 dilution NH2OH addition hydroxamic acid production CONH2 CONHOH amidase NH2OH Obrázek 3 Tvorba hydroxamátu za použití amidasy inhibované amonnými ionty VÝVOJ SCREENINGOVÝCH A ANALYTICKÝCH METOD Chromatografie V mnohých případech je HPLC používána pro stanoveníí koncentrace a monitorování reakčních produktů, a pro kvantifikaci enzymové aktivity. Běžné chromatografické kolony plněné částicemi stacionární fáze jsme v průběhu práce nahradili monolitickými kolonami. Tyto kolony nám dovolily snížit čas analýzy a zároveň snížit množství organické mobilní fáze, a to i přes zvýšení průtokových rychlostí (obvykle úspora 70% organického rozpouštědla v porovnání s částicovou kolonou (Martínková et al., 2008)). Přitom bylo zachováno uspokojivé rozlišení pro všechny testované složky. S benzonitrile (jako referenčním substrátem) byla analýza zkrácena z 10 minut (částicová kolona) na méně než 2 minuty za použití monolitické kolony. Srovnání obou metod na základě retenčních časů je v tabulce 4. Tabulka 4 Srovnání retenčních časů vybraných analytů na různých kolonách Částicová kolona Monolitická kolona Mobilní fáze Analyt acetonitril (%) RT (min) částicová/monolitická 3-Hydroxybenzonitril 7,7 1,82 17 / 10 3-Hydroxybenzoová kys. 3,6 1,09 17 / 10 4-Tolunitril 11,3 2,44 30 / 20 4-Toluová kys. 5,2 1,48 30 / 20 3-Chlorbenzonitril 13,1 2,73 30 / 20 3-Chlorbenzoová kys. 6,7 2,56 30 / 20 Benzonitril 5,7 1,74 30 / 20 Benzoová kys. 3,3 1,18 30 / 20 Benzamid 1,9 0,87 30 / 20 Poznámka: částicová kolona- NovaPak RP-18(Waters), 150mm×3.9mm i.d., 4 μm; monolotická kolona - Chromolith Flash RP-18 (Merck),25mm×4.6mm i.d. UV-Spektrometrie Spektrální metody se zřídka využívají pro přímé měření substrátu a produktů reakcí katalyzovaných nitrilasou. To je způsobeno několika obtížemi spojenými s těmito měřeními. Kyano, karboxamido nebo karboxy skupiny mají nízkou absorbanci v UV/VIS oblasti a ve většině případů pozorujeme jen velmi malé rozdíly v absorbanci mezi substrátem a produkty, jelikož je absorbance ovlivňována především základním uhlíkatým řetězcem. Je zřejmé, že jen sloučeniny s aromatickým kruhem nebo konjugovanými dvojnými vazbami jsou vhodné pro měření v UV oblasti. Celkem bylo vyzkoušeno 16 potenciálních substrátů a překvapivě bylo zjištěno, že téměř všechny zkoušené látky je možné stanovit touto metodou, ačkoliv rozdíl mezi absorbčními maximy substrátu a produktu byl mnohdy méně než 5 nm. Výhodou této metody v porovnání s např. HPLC (end-point metoda) je možnost sledovat průběh reakce přímo, a tudíž je možné pozorovat inhibiční nebo aktivační efekty. Také lze spočítat kinetické parametry. Nicméně možnost tvorby více než jednoho produktu (kyselina, amid) může komplikovat vyhodnocení a určuje tuto metodu pouze pro semi-kvantitativní stanovení. Je třeba použít jinou metodu, pokud je třeba provést detailní analýzu reakční směsi. Naopak UV metoda je rychlá a může být použita např. pro screening. ZÁVĚR Trend v enzymologii se mění od hledání nových enzymů in vivo k přípravě enzymů in vitro modifikací přírodních nebo syntézou úplně jiných proteinů. Nicméně bez dostatečné znalosti a dobrého porozumění přírodním enzymům nemůže být tento trend úspěšný. Nitrilasy jsou známy od 60. let minulého století, ale stále ne všechny vlastnosti těchto enzymů jsou plně pochopeny. V této práci jsme se snažili popsat nové enzymy a získat informace o jejich struktuře a funkci. Oba popsané kmeny Fusarium jsou původně půdní izoláty s nízkou nitrilasovou aktivitou (méně než 4 U.L-1media), ale změnou induktoru a kultivačních podmínek na dvou- krokovou kultivaci jsme dosáhli tisícinásobného zvýšení produkce. Lyofilizované mycelium získané touto cestou bylo stabilní po dobu delší než rok, což činí tento enzym snadno dostupným. Nové nitrilasy purifikované a popsané v této práci náleží k enzymům preferujícím aromatické substráty a v reakčních optimech jsou podobné dříve popsaným enzymům. Jinak je tomu, pokud jde o strukturu, kde některé bakteriální nitrilasy jsou menší než 200 kDa (Thuku et al., 2009), ale námi purifikované nitrilasy z hub jsou větší než 440 kDa. V tomto případě je výhodná elektronová mikroskopie, která odkrývá jejich kvartérní strukturu. Tato technika umožňuje pozorování zrání enzymu sestavujícího se do šroubovitých tyček větších než 1 MDa (Thuku et al., 2007). Tato skutečnost činí stanovení přesné molekulové hmotnosti velmi obtížnou. Velmi potřebnou by byla krystalografické analýza struktury, jež nebyla doposud provedena pro žádný z těchto enzymů a bude to jistě cílem naší skupiny pro příští práci (Kaplan et al., 2010). Pro vyzkoušení použitelnosti nitrilas pro přípravu karboxylových kyselin byly zkoušeny různé imobilizační techniky. Použití membránového reaktoru (CSMR) se ukázalo jako přínosné a to nejen pro přípravu produktů, ale také pro studium stability enzymu v průběhu reakce. Nevýhodou byla nízká produktivita daná malými průtoky, ale výhodou byla nízká spotřeba enzymu. Všechny imobilizační techniky zlepšovaly stabilitu enzymu a jsou vhodné pro možnou přípravu zajímavých enzymatických produktů. Další enzymatický systém náležející do nitrilasové super-rodiny je nitrilhydratasa/amidasa z bakterie Rhodococcus erythtropolis A4. Byl nalezen specifický reversibilní inhibitor (amonný ion) pro amidasu, což činí použití hrubého extraktu mnohem výhodnějším (alternativa k purifikaci šetřící čas). Velmi slibné je použití amidasy při přípravě hydroxamových kyselin (z důvodu jejich hodnoty nejen pro farmaceutický průmysl). Tato práce rozšířila portfolio enzymů nitrilového metabolismu a popsala nové vlastnosti enzymů. Zároveň byla vyvinuta nová metoda pro rychlé stanovení enzymové aktivity.
Abstract v angličtině:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Biochemistry A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy Nitrile-hydrolysing enzymes: Fungal nitrilases Mgr. Vojtěch Vejvoda Supervisor: Ing. Ludmila Martínková, CSc. Laboratory of Biotransformation, Institute of Microbiology, v.v.i. Academy of Sciences of the Czech Republic Consultant: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DrSc. Faculty of Science, Department of Biochemistry, , Charles University in Prague Prague 2010 INTRODUCTION Nitriles are widespread in the environment - not only as the natural products of plants but also as the secondary metabolites of microorganisms or higher organisms. Synthetic nitriles and inorganic cyanides occur as pollutants from human activities (industrial wastes, herbicides, etc.). Both natural and man-made nitriles are poisonous to many organisms, the natural ones serving as a protection against enemies (e.g. herbivores). Their toxic activity is used in some herbicides. However, all of these compounds may exert negative effects on other beings living in the particular environment and create selection pressures, probably leading to the evolution of enzymes catalyzing the detoxification of nitriles, or, even better, utilizing them as the source of energy and nutrients. Nitrile-metabolizing enzymes are relatively rare in organisms, occurring in specific taxons of both prokaryots (nitrilase, nitrile hydratase) and eukaryots (nitrilases). In this work we examined several new microbial enzymes catalyzing the degradation of nitriles (see Fig. 1), with the aim of providing improved tools for organic synthesis, or for the detoxification of waste. R aldoxime dehydratase R R nitrilase HO HO N CH C R N C C R C C R + NH3 + 2H2O H - H2O H O H aldoxime nitrile carboxylic acid nitrile + H2O +HO 2 P450 hydratase amidase H2N R H2N R C C R CH C R O H HOOC H amide of carboxylic acid amino acid Figure 1 Reaction scheme of enzymes connected to metabolism of nitrile compounds R – H or alkyl As much more is known about nitrilases in bacteria than in higher organisms such as fungi, we have primarily chosen the latter group of organisms to broaden our knowledge of these enzymes and to find new biocatalysts with potentially better catalytic properties among these less explored enzymes. In this study the focus was on the Fusarium solani O1 and IMI 196840 (Vejvoda et al., 2008; Vejvoda et al. 2010), their potential to produce nitrilase activity and the structural and catalytic properties of these enzymes. The evaluation of a number of techniques, which may be appropriate for the immobilization of nitrilases as unstable enzymes, was also a part of this research. The following part of the work was concerned with revealing new properties of the alternative nitrile-hydrolyzing enzyme system composed of nitrile hydratase and amidase. This part of the work used a strain of Rhodococcus erythropolis A4. A new amidase expressed in this strain was described and its synthetic potential, namely in acyl- transfer reactions, was exploited. Nitrilase and amidase were applied in cascade systems, in order to increase the purity of biotransformation product (acid) by side product (amide) removal. NITRILASES The problem of activity induction was solved by O.Kaplan (Kaplan et al., 2006) and 2-cyanopyridine was selected as a very useful inducer for all tested filamentous fungi, increasing the nitrilase production by up to three orders of magnitude. Additional conception for nitrilase activity increase was two-step cultivation, which proved to be beneficial for both of the Fusarium genus strains. Another benefit of Fusarium strains are their enzyme stability in the lyophilized mycelium, no activity loss being observed after one year, when the mycelium was stored at -20 °C. Results of activity induction in both Fusarium strain are summarized in Table 1 Table 1 Different methods of cultivation of F. solani strains for nitrilase production Fusarium solani O1 Fusarium solani IMI 196840 Total activity Total activity Increase Increase (U.L-1) (U.L-1) original inducer original inducer 3.2 4 (3-cyanopyridine) (benzonitrile) 2-cyanopyridine as inducer one-step 437 137 cultivation two-step two-step 3000 938 1565 391 cultivation cultivation Purification and structural properties Most nitrilases, including all known fungal enzymes, are high molecular weight proteins (typically more than 400 kDa (O'Reilly and Turner, 2003)) and therefore the purification method of choice is gel filtration. However, the large volume of cell-free extracts was limiting for this method. This led us to choose Phenyl Sepharose (low sub) chromatography as the first step, which led to concentration of the enzyme solution (followed by increasing the protein concentration by centrifugation through membrane filters). Gel filtration on Sephacryl S-200 was then applied as the second step. The final step - ion exchange chromatography using a strong anion exchanger Q Sepharose - yielded only two peaks, which were easily separated to give the nitrilase in high purity. This was confirmed by SDS-PAGE and by circular dichroism measurement (Vejvoda et al., 2008; Vejvoda et al. 2010). The purification of nitrilases is summarized in Table 2. Table 2 Summary of Fusarium nitrilases, purification Specific activity toward Purification Yield Strain benzonitrile (fold) (%) (U mg -1) F. solani O1 9.9 25.7 156 F. solani IMI 196840 20.3 26.8 144 Both enzymes were purified with similar yields of ¼ of the initial activity and similar specific activities toward benzonitrile (reference substrate) - i.e. approx. 150 U.mg-1protein. This specific activity is very high compared to bacterial nitrilases, but is not exceptional in fungal nitrilases. This suggests a significant potential for these enzymes in laboratory and industrial practice. The molecular mass of the subunit, determined by SDS-PAGE, was 40 kDa for both nitrilases. SDS-PAGE was carried out under reducing and non-reducing conditions, and no differences in the migration of bands were observed for either enzyme, suggesting that there were probably no disulfide bonds in the enzyme molecules. Far-UV CD spectra (CD) were used to determine and compare the type of secondary structures of the purified nitrilases. These measurements were done as part of a study-stay at the Loschmidt Laboratory (Masaryk University Brno) under the supervision of Prof. J. Damborský and Dr. R. Chaloupková. Data for both nitrilases from F. solani strains and for the recombinant nitrilase from A. niger K10 were obtained by this method and are displayed in Table 3. Table 3 Secondary structures in nitrilase molecule Organism α-Helix (%) β-Sheet (%) Turn (%) Others (%) Tm (°C) F. solani O1 30 20.8 16.4 32,8 47.8 F. solani IMI 196840 30 21 16.4 32.6 49.3 A. niger K10 - recombinant 26.4 23.5 17.4 32.7 45-50 Catalytic properties As with their structure, both purified enzymes from F. solani species are also very similar in their catalytic properties, except for minor differences in substrate specificity . The highest activity for both enzymes was observed over the range 40 – 50 °C and in slightly alkaline media (pH 8) and purified enzymes exhibited a high specific activity towards benzonitrile - 156 and 144 U.mg-1 protein for enzymes from F. solani O1 and IMI 196840, respectively. This activity is comparable with that in the strain F. oxysporum f.sp. melonis (Goldlust and Bohak, 1989). These enzymes can be classified as aromatic nitrilases according to their substrate specificity, but also accept aliphatic nitriles, although with significantly lower activity. Aromatic nitriles with a substituent at position 2 are generally poor substrates, probably due to steric hindrances. 4-Cyanopyridine and, of the substituted aromatics, 3- chloroxybenzonitrile are among the best substrates for both enzymes. Immobilization To improve enzyme stability, e.g. for long-term reaction, immobilization is generally applied. Most immobilization methods reduce the effect of harmful factors (by forming a microenvironment around the enzyme molecule), fix the structure and attenuate denaturation of the protein backbone. Importantly, immobilization also prevents the leakage of enzyme from the reaction mixture. With nitrilases, we found that mild immobilization techniques (physical adsorption) led to only a small loss of activity, but a leakage of activity was observed, and harsh immobilization techniques (covalent binding) led to significant losses of enzyme activity. We also compared the suitability of the enzymes for use in a batch or continuous reactor. For immobilisation in a continuous reactor (stirred membrane reactor or column) permanent delivery of the substrate and removal of the product shifts the equilibrium towards the reaction products, and the leakage of activity (in case of column reactor) can be alleviated by the addition of a new portion of enzyme (Malandra et al., 2010). For removing the by-product of nitrile hydrolysis (amide) amidase was used (see Figure 2). Two options were tested: the immobilization of nitrilase and amidase on one column (co-immobilization) and immobilization on two separate columns connected together. Both methods led to a reduction in the amount of amide, but with 4-cyanopyridine the use of columns connected in tandem reduced the amount of amide more effectively (to less than 0.2 %) and led to the production of very pure isonicotinic acid. Figure 2 Two enzymes working in accord NITRILE HYDRATASE/AMIDASE ENZYME SYSTE M An alternative enzymatic tool for nitrile biotransformations is the prokaryotic system of nitrile hydratase/amidase. The possibility of controlling the production of amides vs. carboxylic acids by varying the reaction conditions or reaction time is also beneficial. The significant disadvantage of nitrile hydratase, on the other hand, is its much lower stability compared to nitrilase. The physico-chemical properties of amidase and nitrile hydratase seemed to be very similar. Therefore, it was very difficult to separate these two enzymes in Q or Butyl Sepharose columns, the main contribution of this method being the removal of ballast proteins. The separation of both only occurred in the Superdex column, which has superior resolution parameters compared to other gel filtration columns, but its disadvantage is the very low sample volume that can be applied (maximum 500 μl). The preferred substrates of the purified amidase are benzamide and nicotinamide. The purification of amidase was performed with a satisfactory yield of 16 %, but the increase in specific activity was less than 5-fold. This suggested that the enzyme was not purified to homogeneity, which was confirmed by SDS-PAGE. Acyl-transfer reaction It has been reported that amidases are able to transfer acyls onto acyl acceptors other than water. Such acceptors can be amines but also hydroxylamine or hydrazine (Fournand et al., 1998). Reactions involving the latter two acceptors led to hydroxamates and hydrazides as valuable products. Hydroxamates are active as chelating agents and hence find applications as antibiotics (vorinostat), growth factors or tumor inhibitors. We tested the amidase for its acyl transferase activity. The amides were prepared in situ from nitriles using either the nitrile hydratase from the same organism, or heterologously expressed nitrile hydratases (the latter one in collaboration with University of Hohenheim, Institute of Food Science and Biotechnology, where these enzymes have been prepared). In the first step – nitrile to amide conversion – the nitrile hydratase activity of the crude enzyme preparation was exploited. However, the hydrolysis of the desired amide into the unwanted carboxylic acid had to be avoided. Therefore, a selective inhibitor of the amidase was needed. In attempting to solve this problem, we found that ammonia acted as selective inhibitor of the amidase activity. The reversibility of the inhibition is an advantage, since, after decreasing the ammonia concentration below the inhibiting level, the enzyme could be used to catalyze the acyl transfer reaction (amide to hydroxamate conversion). CN CONH2 COOH CONH2 COOH nitrile hydratase amidase + H2O - NH4+, + H2O < NH4+ addition selective (reversible ) + + amidase inhibition NH4 NH4 CN CONH2 COOH CONH2 COOH nitrile hydratase + H2O + X X amidase - NH4+, + H2O >> NH4 + NH+ NH4 4 dilution NH2OH addition hydroxamic acid production CONH2 CONHOH amidase NH2OH Figure 3 Hydroxamate production using amidase inhibition by ammonium ions DEVELOPMENT OF SCREEN ING AND ASSAY METHODS Chromatography In most cases, HPLC was used to monitor the concentrations of nitriles and their reaction products and to calculate enzyme activity. Conventional chromatography columns filled with a particle stationary phase were replaced with monolithic columns during our work. The monolithic columns allowed us to decrease the run time of analyses and, in this way, to decrease the amount of organic solvent consumed despite the higher flow rates (usuallly a saving of 70 % of organic solvent compared to particle column analysis (Martínková et al., 2008)). At the same time, a satisfactory resolution was observed for all determined compounds. With benzonitrile (the reference substrate), the analysis time was shortened from 10 minutes (with particle-filled columns) to less than 2 minutes. A comparison of both methods is shown in Table 4, demonstrating retention times. Table 4 Comparison of retention times of selected analytes on particle and monolithic column Particle column Monolithic column Mobile phase Analytes acetonitrile (%) RT (min) particle/monolithic 3-Hydroxybenzonitrile 7.7 1.82 17 / 10 3-Hydroxybenzoic acid 3.6 1.09 17 / 10 4-Tolunitrile 11.3 2.44 30 / 20 4-Toluic acid 5.2 1.48 30 / 20 3-Chlorbenzonitrile 13.1 2.73 30 / 20 3-Chlorbenzoic acid 6.7 2.56 30 / 20 Benzonitrile 5.7 1.74 30 / 20 Benzoic acid 3.3 1.18 30 / 20 Benzamide 1.9 0.87 30 / 20 Note: Particle column - NovaPak RP-18(Waters), 150mm×3.9mm i.d., 4 μm; Monolothic column - Chromolith Flash RP-18 (Merck),25mm×4.6mm i.d. UV-Spectrometric Measurements UV methods have been rarely used for direct measurement of the substrates and products of nitrilase-catalyzed reactions so far. This was caused by some difficulties connected with this type of measurement. Namely, cyano, carboxamido or carboxy groups exhibited a low absorbance in the UV/VIS range, and in most cases only small differences between the substrate and product were observed. The reason for this is that the main contribution to absorbance originates from the carbon chain. It is obvious that only aromatic compounds or compounds with conjugated double bonds are suitable for UV measurements. In total, 16 substrates were tested using this method and, surprisingly, it was found that nearly all tested compounds were suitable for this method, although the difference between the maximum absorption of the substrate and product was less than 5 nm. A benefit of this method in comparison to the end-point method (e.g. HPLC) is that the reaction can be monitored continuously and, therefore, inhibition or activation effects can be monitored, and also kinetic parameters can be easily calculated. However, the possibility of the formation of other compounds such as amide may complicate the evaluation and makes this method only suitable for semi-quantitative measurements. Therefore, other methods must be used if a detailed analysis of the reaction mixture components is desired. On the other hand, the UV method is very fast and therefore useful for screening. CONCLUSION The trend in enzymology is from finding new enzymes in vivo to preparing enzymes in vitro by altering natural proteins or by the synthesis of completely new ones. However, without broad knowledge and a good understanding of natural enzymes, this new trend cannot be efficient. Nitrilases have been known about since the 1960s, but, as stated above, not all features of these enzymes are understood. In some cases we still have to say hic sunt leones. In this work, we tried to describe new enzymes and obtain information about their structure and function. Both described Fusarium strains are originally soil isolates with minor nitrilase activity levels (less than 4 U.L-1medium), but changing the inducer and cultivation procedure to a two-step cultivation led to an enhancement of their activity to thousands of units per litre of medium. Moreover, lyophilization of the mycelium obtained in this way stabilizes the enzyme for more than a year, which makes the enzyme accessibility very simple and straightforward. New nitrilases purified and characterized in this work seem to belong to enzymes preferentially accepting aromatic nitriles, and to be not too different in terms of reaction conditions from other, previously described nitrilases. They are not so coherent in their structure, because some bacterial nitrilases are less than 200 kDa in molecular weight (Thuku et al., 2009), but the fungal nitrilases purified by us seem to be more than 440 kDa. Electron microscopy is the tool of choice in revealing their quaternary structure. This technique enabled observation of the enzymes maturing by assembling into helical rods (Thuku et al., 2007) with a molecular weight exceeding the upper molecular weight limit of conventional columns. The size of these nitrilase species makes precise determination of the molecular weight of nitrilases difficult. The crystallography analysis of nitrilases will be very useful as the crystal structure has not been determined yet for any of these enzymes, and it is the aim of our group in future research (Kaplan et al., 2010). To determine the applicability of enzymes for the preparation of carboxylic acids, different immobilization techniques were tested in this work. The continuous stirred membrane reactor (CSMR) was found to be a useful technique, not only for the preparation of products but also for studying enzyme stability and behaviour in continuous mode. The disadvantage of this laboratory-scale CSMR used here is its low productivity (due to a low flow rate), but its advantage is a low consumption of enzyme. Nevertheless, all tested immobilization techniques improve enzyme stability and are suitable for the possible preparation of interesting enzymatic reaction products. Another enzymatic system belonging to the nitrilase superfamily is the amidase- nitrile hydratase system from the bacterium Rhodococcus erythtropolis A4. A specific reversible inhibitor (ammonium ions) was found for the amidase, making the use of the crude extract more profitable and time-saving (alternative for enzyme purification). The application of an amidase in the preparation of hydroxamic acids makes this enzyme very promising, because of the high value of hydroxamic acids in pharmaceuticals and elsewhere. This work has broadened the portfolio of nitrile metabolism enzymes a little and new features of the enzymes were determined. At the same time, a new method of fast activity determination was elaborated.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Vojtěch Vejvoda 695 kB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Vojtěch Vejvoda 4.02 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Vojtěch Vejvoda 880 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Vojtěch Vejvoda 796 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Ing. Zdeněk Wimmer 80 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Simona Vosáhlová, CSc. 1.4 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 626 kB